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外珌体介导LincRNAROR通过海绵状吸附miRNA调控免疫细胞CD16a表达影响结直肠癌免疫逃逸的研究
添加时间: 2020-6-14 10:55:33 来源: 作者: 点击数:248

报告正文

 参照以下提纲撰写,要求内容翔实、清晰,层次分明,标题突出请勿删除或改动下述提纲标题及括号中的文字。

(一)立项依据与研究内容(建议8000字以下):

1项目的立项依据(研究意义、国内外研究现状及发展动态分析,需结合科学研究发展趋势来论述科学意义;或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录);我们

研究意义

CDI6a对特异性和非特异性免疫均起主要作用,作为IgGFc的特异性结合受体,它是机体细胞免疫和体液免疫发挥作用的主要桥梁。当免疫效应细胞CDI6a表达减弱时,就会使其结合的IgG的量减少,不仅使抗体激活NK细胞等效应细胞的作用减弱,更会使募集到肿瘤局部的免疫效应细胞的数目减少,从而大大降低抗体介导的细胞免疫功能杀伤肿瘤细胞或恶性变细胞的作用 我们在前期研究中采用基因芯片技术和RT-PCR技术分析结直肠癌患者原发肿瘤组织中基因表达情况时发现,CDI6a在结直肠癌组织明显低于癌旁正常肠壁组织,有肝脏转移的结直肠癌患者原发肿瘤组织中表达明显低于无肝脏转移者[1-2],说明结直肠癌患者肿瘤局部微环境中存在免疫抑制现象。这一方面会加速结直肠癌的进展。另外还可能会影响患者免疫治疗,靶向治疗的疗效。而造成上述结直肠癌患者CDI6a表达减弱的原因目前还未检索到这方面的文献。鉴于CDI6a在免疫方面所起的作用,行进一步的研究不仅能探索影响结直肠癌发生发展的免疫因素,而且可能对提高免疫治疗,靶向治疗疗效提供新的靶点。

国内外研究现状及发展动态分析与存在的问题

结直肠癌在我国已占我国恶性肿瘤的第四位[3],其发生和发展是一个多步骤、多因素、序贯的复杂过程,是环境因素、个体因素、遗传因素等多方面因素相互作用的结果,涉及机体的免疫系统功能状态与恶性肿瘤的细胞免疫逃逸机制变化的平衡 [4-5]。机体的免疫状况与恶性肿瘤的发生和发展有着密切的联系6】,正常情况下,机体免疫系统能够识别并杀伤恶性转变的细胞[7]。恶性肿瘤的发生和发展一方面与肿瘤细胞抗原缺失(包括肿瘤细胞不表达抗原表位、抗原加工缺失、抗原调变、抗原脱落等)导致免疫效应细胞不能识别恶性变细胞有关6,8】,另一方面,免疫效应细胞的功能缺失如缺乏抗原递呈细胞、效应细胞表面的受体不表达或表达减弱等将影响免疫效应细胞的功能,这些将导致恶性变的细胞得以逃脱免疫监视而持续生长繁殖最终形成临床上可见的恶性肿瘤9-10】而机体上述免疫功能的变化是如何发生发展的,涉及到哪些物质的相互作用,目前仍知之甚少

CDI6a (Fc fragment of IgG,low affinity IIIa  receptor),或淋巴细胞表面CDI6a,也称为CDI6a,为低亲和力的IgG受体,是一种表达于自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞等[30-31]免疫效应细胞表面相对分子量为50000—70000的跨膜糖蛋白,是机体细胞免疫功能发挥作用的一个比较重要的结合位点,CDI6a对免疫效应细胞发挥抗肿瘤作用不可或缺。CDI6a功能包括与人IgG1、IgG3的Fc段结合,诱导NK细胞等免疫效应细胞的细胞毒作用—即抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)杀伤靶细胞[31];直接介导NK细胞对肿瘤靶细胞的杀伤和巨噬细胞的吞噬功能等作用[30-32]促进IL-1,IL-4,IL-10,IL-13,IFN-γ,TNF和基质金属蛋白酶的产生,从而影响细胞免疫功能的发挥[33]

CDI6a对特异性和非特异性免疫均起主要作用,作为IgGFc的特异性结合受体,它是机体细胞免疫和体液免疫发挥作用的主要桥梁。当免疫效应细胞CDI6a表达减弱时,就会使其结合的IgG的量减少,不仅使抗体激活NK细胞等效应细胞的作用减弱,更会使募集到肿瘤局部的免疫效应细胞的数目减少,从而大大降低抗体介导的细胞免疫功能杀伤肿瘤细胞或恶性变细胞的作用 [34]

目前的一些临床研究结果显示35-39]CDI6a有影响免疫效应细胞抗多种肿瘤的作用,当增强CDI6a表达时效应细胞细胞因子诱导杀伤细胞(Cytokine—Induced Killer, CIK)对胃癌细胞的杀伤能力明显增强,而用抗CDI6a的抗体可以阻断CIK细胞对白血病、恶性淋巴瘤的杀伤作用。用免疫球蛋白可以使免疫细胞的CDI6a表达变化而使其抑制肿瘤细胞增殖的能力减弱。ADCC作用效果与CDI6a和抗体的相互作用有关,有更多CDI6a结合位点的病人接受靶向药物rituximab(利妥昔单抗)能够获得更好的疗效。我们曾通过慢病毒转染的方法在∪937单核细胞中导入CDI6a 基因,结果显示CDI6a过表达的∪937单核细胞能够增强西妥昔单抗对结肠癌细胞的杀伤作用及抑制其侵袭能力。说明通过增加CDI6a的表达可能增加靶向药物的结合位点而增强靶向治疗药物的疗效[40]。这些研究结果表明CDI6a表达强度不仅影响免疫细胞功能,还影响靶向治疗药物的疗效。对其调控机制深入研究,不仅能丰富机体免疫功能调控的理论意义,而且对提高病人靶向治疗疗效有帮助。

外泌体是直径为30~100nm,具有双层分子膜结构的呈球形囊状小体,几乎所有类型的体细胞如淋巴细胞,内皮细胞以及肿瘤细胞都能释放外泌体,其广泛存在于血清、血浆、尿液、母乳及各种恶性体液中[11-12]。外泌体中 的 成 分较为复杂,包括 蛋 白 质、酶类、DNA,mRNA、非编码 RNA 及脂质以及细胞因子、生长因子受体等生物活性物质[13]。外泌体的作用包括[14-18],(1) 细胞间通讯作用。(2) 调节肿瘤微环境。(3)免疫相关作用。恶性肿瘤病人外泌体的释放远多于正常人,肿瘤来源外泌体主要通过与其亲本细胞相同的生物活性物质发挥作用,通过在细胞间传递DNA,mRNA,miRNA以及癌蛋白等生物化学物质来改变靶细胞的表型以及生物学行为,通过调控肿瘤局部微环境,影响丅细胞,Nk细胞,DC细胞等免疫效应细胞的抗肿瘤作用来影响肿瘤的发生发展[19-20]。

LincRNA-ROR(Large intergenic non-coding RNA-regulator of reprogramming,LincRNA-ROR,基因间长链非编码RNA-重编码调控因子)是基因间长链非编码RNA (Long  non-coding RNA, LncRNA)的一种19],是外泌体携带的众多生物活性物质之一,它由4个外显子组成。与众多的LncRNA一样,LincRNA-ROR也不编码蛋白质,而是以RNA的形式参与包括启动子结合,染色质重构,组蛋白修饰,转录及转录后调节下游基因的表达,细胞间信号传递等生物学过程来起作用。目前的研究显示,它在与miRNA的相互作用,维持干细胞多能性方面起调控作用,也可以激发上皮-间充质转化(epi-to-mesenchymal transition,EMT),对肿瘤的发生起重要的促进作用。内源性竞争性RNA(Competing endogenous RNA,ceRNA )模式是LincRNA-ROR的作用模式之一,它可以与靶基因的mRNA分子竞争性吸附结合共同的miRNA,发挥分子海绵的作用,使与靶基因mRNA结合的miRNA的数量减少,导致靶基因表达水平发生变化而发挥其生物学作用20-22]

由于外泌体特殊的结构,一方面可以保护内部的生物活性物质不被降解,还可将这些物质运输到特定细胞发挥作用23]。目前的硏究表明,结直肠癌普遍存在释放过多外泌体及LincRNA-ROR的高表达的情况24] LincRNA-ROR的表达变化可以引起一些基因如p53及其靶基因的蛋白表达水平发生能有利于结直肠癌细胞增殖的变化,敲除了LincRNA-ROR的结直肠癌细胞放疗敏感性会増加,LincRNA-ROR 作为ceRNA通过结合miR-145调节Oct4,Sox2和Nang的表达而影响结直肠癌干细胞增殖及化疗敏感性25-28],高表达LincRNA-ROR的结直肠癌患者总生存期(OS)及无病生存期(DFS)均缩短29]。那么LincRNA-ROR是否会通过影响与机体免疫细胞抗肿瘤功能有关的一些基因的表达来影响免疫细胞的功能呢?

我们的前期研究结果显示,CDI6amRNA在结直肠癌组织的表达明显低于癌旁正常肠壁组织(1),有肝脏转移的结直肠癌患者原发肿瘤组织中的表达明显低于无肝脏转移者[2]其原因目前仍不清楚。正如前述,结直肠癌病人外泌体及LincRNA-ROR表达明显高于正常人,那么它们的增多是否与CD16a的低表达之间有联系?结直肠癌病人外泌体LincRNA-ROR的增加是否通过影响免疫细胞CD16a的表达来影响免疫细胞的抗肿瘤作用,从而有利于结直肠癌的发生和发展?关于它们之间的关系目前未查到相关的报导。我们推测结直肠肿瘤患者外泌体中携带的LincRNA-ROR作为内源性竞争性RNA,通过结合较多的与CDI6a基因结合的miRNA,发挥分子海绵的作用,从而减少与CDI6a基因的mRNA结合的miRNA数量,导致CDI6a基因表达水平降低,进而使CDI6a受体蛋白合成下降导致免疫效应细胞表面的结合位点不足而影响其抗肿瘤作用,诱导结直肠癌免疫逃逸。开展深入研究不仅能探索肿瘤与免疫系统的相互作用机理,还可为结直肠癌靶向治疗富集有效治疗人群提供新的依据,寻找到新的提高靶向治疗疗效的新靶点。

为验证上述假设,我们将从分子,体外细胞及活体动物水平研究在外泌体介导的LincRNA-ROR作用下,免疫细胞CDI6a表达变化对结直肠癌细胞杀伤功能的变化及其作用机理探讨CDI6a所介导的免疫功能的变化对EGFR单抗靶向治疗效果的影响,希望为提高结直肠癌靶向治疗的疗效提供新的研究思路

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2项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题(此部分为重点阐述内容)

研究目标

在前期工作的基础上,进一步研究:(1)结直肠癌患者外泌体来源的LincRNA-ROR和免疫细胞CDI6a基因表达的相关性;(2)明确外泌体来源的LincRNA-ROR作为内源性竞争RNA通过抑制机体免疫细胞表面CDI6a基因表达,以及对免疫细胞抗肿瘤功能的影响;4)探讨外泌体来源的LincRNA-ROR和免疫细胞CDI6a基因导致结直肠癌细胞逃避免疫系统的机制。从探讨外泌体来源的LincRNA-ROR在改善单抗靶向药物抗肿瘤作用的意义,希望为提高结直肠癌单克隆抗体靶向治疗的疗效提出新思路。

研究内容

本课题研究内容如下:

1),首先通过检测结直肠肿瘤病人血清外泌体中LincRNA-ROR与免疫细胞中CDI6a表达,探讨两者的相关性。采用 RT-PCR技术。

2)寻找外泌体中LincRNA-ROR影响免疫细胞中CDI6a表达的证据。采用iRNA技术。

3)进行体外细胞功能试验:本部分通过研究发生CDI6a表达变化的免疫细胞(LincRNA-ROR影响)对直肠癌细胞生物学行为的影响。

4)裸鼠体内功能实验,进一步验证体外实验的实验内容(活体水平)。

5)根据实验结果,对肿瘤来源外泌体中LincRNA-ROR干预下CDI6a基因表达变化的免疫细胞影响肿瘤细胞生长及肿瘤细胞凋亡的机制进行分析。

本课题分为以下几部分:

1),结直肠肿瘤病人血清外泌体中LincRNA-ROR与免疫细胞中CDI6a表达的相关性研究

本部分将分别从结直肠癌患者血清提取肿瘤来源外泌体和免疫细胞,然后采用RT_PCRRT-PCR技术分别检测外泌体中LincRNA-ROR与免疫细胞中CDI6a mRNA的表达。进行检测。对两检查结果进行相关性分析。初步探明两者的相关性,是正相关?负相关?不相关?

我们在前期研究中采用基因芯片技术和RT-PCR技术分析结直肠癌患者原发肿瘤组织中基因表达情况时发现,CDI6a在有肝脏转移的结直肠癌患者原发肿瘤组织中表达明显低于无肝脏转移者[26],结直肠癌组织明显低于癌旁正常肠壁组织,说明结直肠癌患者存在CDI6a基因表达受抑制的现象,而根据目前的研究报道,结直肠癌患者外泌体及LincRNA-ROR呈高表达状态,那么这两者之间是否存在相关性,肿瘤病人外泌体中LincRNA-ROR的高表达是不是引起免疫细胞CD16a表达减少的原因,由此使免疫细胞功能受抑制而加速结直肠癌的进展?

按预期结果,结直肠癌患者血清外泌体和免疫细胞中LincRNA-ROR与免疫细胞中CDI6a mRNA的表达呈负相关性。

2)寻找外泌体中LincRNA-ROR影响免疫细胞中CDI6a表达的证据。

本部分主要是通过siRNA技术,通过导入LincRNA-ROR的同源双链RNA,使LlncRNA-ROR的mRNA特异性降解,达到抑制其作为ceRNA作用的目的。通过RT-PCR技术检测免疫细胞CDI6a的表达情况,对应用siRNA和对照组的表达进行比较。从实验预期看,实验组免疫细胞CDI6a的表达应该比对照组高。表明LincRNA-ROR可以影响免疫细胞CDI6a的表达,进而影响其功能的发挥。如果表达无别,则说明LlncRNA-ROR不影响免疫细胞的表达。

本部分实验内容包括:

设计LincRNA-ROR基因siRNA。结直肠癌细胞株进行培养,然后提取外泌体,采用电子显微镜观察外泌体并对其进行鉴定。免疫细胞培养,免疫细胞摄取外泌体,采用荧光共聚焦实验对其进行检测。

免疫效应细胞LincRNA-ROR基因沉默载体及细胞转染:分别采用siRNA技术和慢病毒转染。采用慢病毒转染外源基因转移技术建立免疫效应细胞CDI6a基因过表达载体,采用RNA干扰技术阻断免疫效应细胞CDI6a基因的表达。

通过流式细胞仪的FITC通道进行细胞分选,采用实时荧光定量PCR法和Western Blot分别对免疫细胞LincRNA-ROR mRNA和CDI6amRNA和蛋白的表达情况进行鉴定。得到符合实验设计要求的表达载体进行下一步实验。说该部分是本课题的关键部分,一方面明确外泌体中LincRNA-ROR是否影响免疫细胞CD16a的表达,还为下一步准备实验材料。

3),在肿瘤来源外泌体中LincRNAROR影响的具有CD16a同表达水平的免疫细胞对结直肠癌细胞生物学行为的影响:体外细胞功能试验

本部分实验主要验证不同表达水平CDI6amRNA的免疫细胞对结直肠癌细胞增殖变化的影响。

通过免疫效应细胞和肿瘤细胞共培养,观察内容如下:

A. 肿瘤细胞增殖变化情况;

B. 检测细胞克隆形成能力变化;

C. 肿瘤细胞侵袭情况变化;

D. 肿瘤细胞的周期变化;

E. 检测细胞因子分泌变化情况;

F. 肿瘤细胞凋亡情况。

G. RT-PCR测定CDI6a基因mRNA表达情况;

H. Western blot 测定CDI6a基因蛋白表达情况。

4),裸鼠体内功能实验

进一步在活体内对体外实验内容进行验证。

建立裸鼠结直肠癌模型,采用细胞株。本部分实验拟进一步验证体外实验的结果。实验研究指标如下:

各组肿瘤平均体积,平均重量;

肿瘤细胞周期和肿瘤细胞凋亡情况;

RT-PCR测定目标基因mRNA表达情况;

Western blot 测定目标基因蛋白表达情况。

肿瘤组织中细胞因子变化结果。

5),机制探讨

A肿瘤细胞生长变化的机制

外源干预下肿瘤细胞Wnt/β-catenin信号通路关键分子β-cateniln的检测;

Real-time PCR 及 Western blot 检测与细胞生长相关靶基因PCNA及Survivin蛋白的表达;

细胞因子检测:免疫抑制因子IL-10,IL-35和TGF-β;免疫杀伤因子颗粒酶,穿孔素和IFN-γ的检测。

B肿瘤细胞凋亡机制研究

早期细胞凋亡:

采用细胞膜变化(Annexin V检测)、caspase 活化以及线粒体膜压变化检测早期细胞凋亡。

晚期肿瘤细胞凋亡的下游通路。

1)检测活性氧(Reactive oxygen species,ROS);

2)检测 Fas/FasL,Bcl-2 的 mRNA 及蛋白水平。

拟解决的关键科学问题

本研究通过几方面的实验,提供可靠的数据,阐述外泌体LincRNA-ROR通过影响免疫细胞CD16a的表达来影响免疫细胞的抗肿瘤功能,在影响结直肠癌免疫逃逸方面的作用,拟解决的键问题为:1,外泌体介导的 lincRNA-ROR能否影响免疫细胞Fcr的表达,从而影响免疫细胞的抗肿瘤功能?  2,初步阐明lincRNA-lincRNAROR在结直肠癌免疫逃逸中的作用。3,为结直肠癌的靶向治疗提岀新的富集有效治疗人群的靶点。供可靠的数据,阐述外泌体LincRNA-ROR

3拟采取的研究方案及可行性分析(包括研究方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明);

拟采取的研究方案(研究方法及实验手段)

包括以下5方面内容:

(一),结直肠患者血清外泌体中LincRNA-ROR与免疫细胞CD16a表达的检测,初步探明两者之间的相关性。

a,血清来源:结直肠癌病人,包括远处转移,淋巴转移,无转移,初步选60例各期结直肠癌;20例正常人血清,作为对照。

b,外周血外泌体的分离,纯化及鉴定。鉴定:NTA径粒仪;蛋白印迹法检测表面标志物;外周血免疫细胞的分离。

c,外泌体及免疫细胞总RNA的提取。

d,RT-PCR检查外泌体中LincRNA-ROR和免疫细胞中CD16a表达的检测。

e,对结果进行统计分析。

(二)寻找外泌体中LincRNA-ROR影响免疫细胞中CD16a表达的证据。

a,细胞培养:包括结直肠癌细胞,免疫细胞,结直肠癌细胞和免疫细胞共培养。

b,建立免疫效应细胞LincRNA-ROR基因siRNA表达载体。采用RNA干扰技术。内容包括:

设计针对LincRNA-ROR基因并合成siRNA;

肿瘤来源外泌体(TEXs)的提取及电镜观察:从培养的结直肠癌细胞中提取。

载体的建立及细胞转染:siRNA设计和制备。针对LincRNA-ROR基因设计并合成siRNA。并用软件分析证实该序列不与任何人类基因序列同源。靶mRNA的选取,需设计多个位点的siRNA,从中筛选最有效的siRNA序列。

免疫细胞摄取外泌体。采用荧光共聚焦实验观察。免疫细胞转染LincRNA-ROR:采用慢病毒转染。将处于对数生长期的免疫效应细胞接种,到细胞密度达到30%-50%,开始转染。采用慢病毒转染试剂制备慢病毒-siRNA-LincRNA-ROR复合物,加入培养的免疫效应细胞中。

分别设立转染组(转染siRNA-LincRNA-ROR),阴性对照组(转染无关序列的siRNA),慢病毒对照组(加入lipofenctamin )和空白对照组(加入等量培养液),转染8小时。

转染细胞的分选:采用流式细胞术进行分选。

目标载体鉴定:用RT-PCR法检测免疫效应细胞LincRNA-ROR(判断转的效果),CD16amRNA表达水平以鉴定转染产物,采用Western blot 检测目标蛋白的表达水平。

外泌体内吞检测:激光共聚焦显微镜。本课题组在前期研究中已经通过慢病毒转染成功建立免疫细胞CD16a基因过表达载体(重庆医学,2020.49(6))。已熟练掌握该项技术。

通过比较实验组各对照组目标基因mRNA和蛋白表达水平的差异,判断LincRNA-ROR对目标基有无作用。

(三)进行体外细胞功能试验:

观察发生CD16a表达变化的免疫细胞(LincRNA-ROR影响)对直肠癌细胞增殖的影响。

将结直肠癌细胞株细胞和免疫细胞共同培养,按肿瘤细胞为2×106/ml,并按上述(二)中的分组加入相应的药物各50μl加入96孔培养板共同培养8小时。每组设6孔。以下列检测指标对结直肠细胞在转染不同水平的LincRNA-ROR介导下CD16a表达不同的免疫效应细胞杀伤效率的检测。

研究内容包括

1)流式细胞术:检测肿瘤细胞的周期、凋亡

2)CCK-8法:检测构建成功LincRNA-ROR基因过表达的细胞、肿瘤细胞增殖情况

3)克隆形成实验;检测细胞克隆形成,了解细胞生长情况。

4)Transwell:检测肿瘤细胞迁移及侵袭情况。

5)ELISA(或流式细胞术微球阵列法)检测基因过表达免疫细胞的细胞因子分泌情况包括:免疫抑制因子IL-10,IL-35和TGF-β,免疫杀伤因子颗粒酶,穿孔素和IFN-γ。

6)RT-PCR测定CD16a基因,Fas/FasL,Bcl-2基因,β-catenin PCNA及Survivin mRNA表达情况。

7)Western blot 测定CD16a基因,Fas/FasL,Bcl-2基因,β-catenin PCNA及Survivin蛋白表达情况。

(四),体内敏感性试验:

裸鼠体内功能实验,进一步验证体外实验的实验内容(活体水平)。

A,建立裸鼠皮下移植瘤模型。先将结直肠癌细胞株在培养板中培养到对数生长期,然后将肿瘤细胞接种于2-3只裸鼠皮下,待移植瘤稳定生长后(一般为移植后10-14天左右)开展下步实验。我们曾建立裸鼠皮下细胞株移植瘤(中华实验外科杂志,2003.20(1)及用结直肠癌病人的肿瘤细胞建立移植瘤模型(贵阳医学院学报,2010,35;中国普外基础与临床杂志,2013,20(1)),对建立动物移植瘤模型技术细节熟练掌握。

B,实验分组,同(二)中的分组相同进行体内实验,每组动物3只。

C,细胞培养:上述(二)中分组的免疫细胞进行细胞培养,然后进行下一步实验。

D,治疗实验,将C中培养的免疫细胞采用腹腔内注射的方法进行治疗试验,时间为1周。

E,实验观察指标:

肿瘤生长情况:各组肿瘤平均体积,平均重量。

流式细胞仪检测肿瘤的细胞周期和肿瘤细胞凋亡情况。

RT-PCR测定目标基因mRNA表达情况;

Western blot 测定目标基因蛋白表达情况。

液态芯片技术检测细胞因子变化,包括免疫抑制因子IL-10,IL-35和TGF-β,免疫杀伤因子颗粒酶,穿孔素和IFN-γ。

(五),外泌体中LincRNA-ROR影响免疫细胞中CD16a表达后对结直肠癌细胞生物学行为影响的机制探讨

根据实验结果,对外源干预下CD16a基因表达变化的免疫细胞影响结直肠癌细胞生物学行为及肿瘤细胞凋亡的机制进行分析。

A肿瘤细胞生物学行为变化的机制

1)外源干预下肿瘤细胞Wnt/β-catenin信号通路关键分子β-catenin mRNA和蛋白变化的检测;

2)Real-time PCR 及 Western blot 检测与细胞生长相关靶基因PCNA及Survivin mRNA和蛋白变化的检测;

3)细胞因子的检测(免疫抑制因子IL-10,IL-35和TGF-β;免疫杀伤因子颗粒酶,穿孔素和IFN-γ的检测)。

B肿瘤细胞凋亡机制研究

早期细胞凋亡:采用细胞膜变化(Annexin V检测)、caspase 活化以及线粒体膜压变化检测早期细胞凋亡。流式细胞术检测线粒体膜压力(Mitochondrial membrane potential, MMP)变化,细胞内 Caspase 3,7,9 含量。

晚期凋亡:我们还将采用PARP 酶降解法检测晚期凋亡,寻找参与诱导细胞凋亡的下游通路:

1) 流式细胞术检测活性氧(Reactive oxygen species,ROS)。

2) Real-time PCR 及 Western blot 检测 Fas/FasL,Bcl-2 的 mRNA 及蛋白水平。

技术路线图

技术路线       

                                            

参考文献

1) 颜登国,区庆嘉,李江涛。奥曲肽抑制裸小鼠肝脏移植瘤生长的研究。中华实验外科杂志,2003.20(1):88.  

2) 张东兴,颜登国,赵丙波。人大肠癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立。贵阳医学院学报,2010,35(3):47-50.

3) 甄运寰,颜登国,张东兴,李国胜,龚慧。人结直肠癌化疗药物的裸鼠体内敏感性试验。中国普外基础与临床杂志,2013,20(1):48-53.

4) 梁正子,曹飞龙,颜登国,王磊,徐伟,龙佑萍。CD16a对∪937单核细胞联合西妥昔单抗杀伤结直肠癌细胞作用的影响。重庆医学,2020.49(6):866—871.

5) 结直肠癌微环境中细胞因子的表达及其与 CD16a 表达的相关性研究。中国普外基础与临床杂志 ,2019 年 11 月第 27 卷第 x:1-7。网络出版地址:http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1505.R.20191113.1658.008.html

                                                            

可行性分析

A理论可行:恶性肿瘤外泌体的释放远多于正常人,结直肠癌细胞外泌体及LincRNA-ROR的表达明显高于正常组织,LincRNA-ROR可影响一些基因的表达从而影响其功能。我们的前期研究显示,结直肠癌存在CD16a的表达减少,因此LincRNAROR通过内源性竞争RNA的模式影响CD16a的表达从而影响免疫细胞的功能,导致结直肠癌逃避机体的免疫监视从理论上是可能的,开展这方面的研究也是可行的。

B技术可行性:本课题组长期进行结直肠癌相关的实验研究,包括用RT-PCR技术检测结直肠患者血液中微转移的研究,大肠癌体外药物敏感性实验研究,基因芯片技术在结直肠癌肝转移患者中的应用,裸鼠结直肠癌动物模型的建立等。近年来开展的实验技术包括细胞培养技术,动物实验研究技术,免疫组织化学技术,RT-PCR技术,流式细胞术,慢病毒转染RNA干扰技术等技术。

C实验条件可行:我单位有贵州省最先进的分子生物学实验室,有满足实验需求的动物实验室及常规细胞培养实验室。

D研究人员的可行性:申请人长期从事结直肠癌的基础与临床方面的研究,在攻读硕士和博士研究生期间系统学习和掌握了分子生物学实验技术。本研究团队长期从事结直肠恶性肿瘤的临床及基础研究,先后开展肿瘤细胞培养,免疫细胞培养,动物移植瘤模型建立,动物肿瘤实验研究,慢病毒转染等分子生物学实验

4本项目的特色与创新之处;

本项目的特色:在我们的前期研究中发现,结直肠癌存在CD16amRNA表达下降,由于CD16a功能包括与人IgG1、IgG3的Fc段结合,是肿瘤局部免疫效应细胞发挥抗肿瘤作用和介导单克隆抗体靶向治疗恶性肿瘤的一个重要的结合位点,其缺乏不仅影响免疫功能,还会影响靶向治疗等的疗效。因此进一步揭示其影响因素,不但能丰富恶性肿瘤免疫功能变化的理论机理,还有可能为进一步研究疫苗打基础以及富集靶向治疗有效治疗人群提供新靶点。   

本项目的创新之处:本课题结合目前关于外泌体LincRNA/ROR的研究成果,结合我们的期CD16a方面的研究结果,凝结出科学问题并提出自己的假说:外泌体中LincRNA-ROR通过内源性竞争性RNA的模式调控免疫细胞CD16a基因的表达,从而影响免疫细胞的抗结直肠肿瘤作用。因此本研究具有理论上的创新,还能为临床靶向治疗提高疗效带来新的希望。

5年度研究计划及预期研究结果(包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等)。

1)年度研究计划安排

2021,01-----2021,06:实验准备阶段:采购实验需要的材料。

2021,07---- 2023,12:实验研究阶段。

2023,07 ----2024,06:分析总结阶段:对数据进行整理,分析,总结,撰写论文,文章投出,参加学术会议等。

2024,01 ----2024,12:论文发表阶段,结题,最终项目总结。   2)预期研究结果

a,结直肠癌患者外泌体LincRNA-ROR与免疫细胞CD16a表达之间存在负的相关性

b,初步明确结直肠癌患者外泌体LincRNA-ROR对免疫细胞CD16a表达的影响,进而影响免疫效应细胞对结直肠癌细胞生长方面的作用,初步探明其作用机制:影响肿瘤细胞凋亡,影响肿瘤细胞增殖,导致细胞因子分泌异常。

c,在国内外专业医学刊物上发表论文2-4篇。

d,培养科研人才2-3名。

(二)研究基础与工作条件

1研究基础(与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩);

本项目相关的研究工作积累:

申请人在攻读硕士和博士研究生期间系统学习和掌握了分子生物学实验技术,先后主持和参与了10余项贵州省、贵阳市、贵阳医学院和所在医院的科研课题,在结直肠癌的基础与临床方面的研究上取得了一定的成绩。本课题组长期从事结直肠癌的基础与临床方面的研究,近期开展的结直肠癌临床及基础方面的已结题的研究有,介入灌注/栓塞化疗在结直肠癌的的应用,结直肠癌患者血液中微转移的研究,大肠癌裸鼠体内移植瘤的化疗药物敏感性实验研究,基因芯片技术在结直肠癌肝转移患者中的应用,免疫效应细胞CD16a表达变化影响抗EGFR单克隆抗体结直肠癌细胞杀伤能力的研究等。这些研究涉及细胞培养,动物实验技术,分子生物学实验技术和免疫组织化学技术,为本研究提供了技术积累。

在前期采用基因芯片技术分析结直肠癌肝转移患者免疫基因表达的变化的研究中发现有肝转移的结直肠癌患者原发肿瘤组织中FCγRⅢAmRNA表达明显低于无肝脏转移的患者,采用慢病毒转染的技术成功建立免疫细胞U937的CD16a(FCγRⅢA)过表达载体并进行CD16a表达情况不同时的U937单核细胞联合抗EGFR单抗对DLD-1结直肠癌细胞杀伤力检测的实验,并通过流式细胞仪检测DLD-1细胞凋亡及周期情况的研究,显示CD16a(FCγRⅢA)过表达的免疫细胞能够增强抗EGFR单抗对DLD-1结直肠癌细胞细胞杀伤作用和增加肿瘤细胞凋亡的发生。这些实验结果和技术均是我们本课题研究的基础。

已取得的研究工作成绩

 论著

(1)梁正子,曹飞龙,颜登国,王磊,徐伟,龙佑萍。CD16a对∪937单核细胞联合西妥昔单抗杀伤结直肠癌细胞作用的影响。重庆医学,2020.49(6):866—871.

(2)结直肠癌微环境中细胞因子的表达及其与 CD16a 表达的相关性研究。中国普外基础与临床杂志 ,2019 年 11 月第 27 卷第 x:1-7。网络出版地址:http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1505.R.20191113.1658.008.html

(3)l梁正子# 颜登国* 李国胜, 程海玉. Clinical Analysis of Primary Colorectal Signet-Ring Cell Carcinoma, Clinical Colorectal Cancer, 2018.3.20, 17(3): e39~e44    (期刊论文)

(4)李沫#; 颜登国; 刘杰麟*. 结直肠癌组织中PCDH10、RASSF1A基因启动子甲基化状态[J]., 中华医学杂志, 2016.02.16, 96(6): 456~459   (期刊论文)

(5)陈 健# 张宏,颜登国*  . 结直肠癌患者围手术期死亡风险评估, 中华普通外科杂志, 2014.9.25, 29(9): 708~711    (期刊论文)

 (6)甄运寰#, 颜登国*, 张东兴, 李国胜, 龚慧. 人结直肠癌化疗药物的裸鼠体内敏感性实验, 中国普外基础与临床杂志, 2013.1.25, 20(1): 48~53    (期刊论文)

(7)颜登国#, 王国栋, 程海玉*. 基因芯片技术分析结直肠癌肝转移患者免疫基因表达的变化, 中国普外基础与临床杂志, 2012.11.25,19(11): 1182~1186    (期刊论文)

 (8)颜登国#, 张汝一, 甄运寰*, 李国胜; 姬清华. 结直肠癌患者血液中CK20 mRNA的表达, 中国普外基础与临床杂志, 2011.2.25, 18(2): 164~167    (期刊论文)

 (9)颜登国#, 张汝一, 甄运寰, 姬清华, 程海玉; 李国胜. 结直肠癌肝转移的治疗, 中华普通外科杂志, 2010.02.25, 25(2): 170~171    (期刊论文)

(10)颜登国#*, 张汝一, 程海玉, 甄运寰, 姬清华. 影响结直肠癌肝转移预后的因素, 中华临床医师杂志, 2009.3.25, 3(2): 242~251    (期刊论文)

(11)颜登国#*, 张汝一, 鞠冬阳, 甄运寰, 姬清华. 结直肠癌肝转移的危险因素分析。, 中华消化外科杂志, 2008.4.23, 7(4): 287~289   (期刊论文)

(12)颜登国#, 区庆嘉, 魏箐. 奥曲肽抑制体外培养人肝癌细胞生长的实验研究, 中华普通外科杂志, 2005.9.25, 20(9): 600~601    (期刊论文)

专著:

颜登国。结肠直肠及肛门疾病图谱-专著,贵州科技出版社,23万字,2012。

获得学术奖励

颜登国(5/7), 消化系统恶性肿瘤放化疗及预后的临床研究, 贵州省人民政府, 科技进步, 三等奖, 2017.3.23(王文玲; 邓艳红; 文小平; 周建奖; 颜登国; 董洪敏; 王刚)

2工作条件(包括已具备的实验条件,尚缺少的实验条件和拟解决的途径,包括利用国家实验室、国家重点实验室和部门重点实验室等研究基地的计划与落实情况);

本申请者所在单位的实验室具有免疫组织化学及分子生物学研究的基本条件。包括层流工作室、YS-875超净工作台、Heraeus CO2培养箱、SANYO深低温冰箱和液氮罐、Heraeus ER-380高速低温离心机、9600型DNA扩增仪(PE公司)、1000/500型电泳仪(BIO—RAD公司)、分光光度计(U—2000,Hitachi)、TR—A型紫外线检测仪、各种微量加样器几、流式细胞计仪、酶标仪、PCR仪等。

3正在承担的与本项目相关的科研项目情况(申请人和项目组主要参与者正在承担的与本项目相关的科研项目情况,包括国家自然科学基金的项目和国家其他科技计划项目,要注明项目的名称和编号、经费来源、起止年月、与本项目的关系及负责的内容等);

项目名称:免疫效应细胞CD16a表达变化影响抗EGFR单克隆抗体结直肠癌细胞杀伤能力的研究。项目编号:Y-MX2015-072;经费来源:北京市希思科临床肿瘤学研究基金会;起止年月:2016,1—2020,12;项目负责人:颜登国;与本项目的关系:该项目为申请项目的前期研究,已经建立通过慢病毒转染建立CD16a基因(FCγRⅢA)过表达载体。

4完成国家自然科学基金项目情况(对申请人负责的前一个已结题科学基金项目(项目名称及批准号)完成情况、后续研究进展及与本申请项目的关系加以详细说明。另附该已结题项目研究工作总结摘要(限500字)和相关成果的详细目录)。

(三)其他需要说明的问题

1. 申请人同年申请不同类型的国家自然科学基金项目情况(列明同年申请的其他项目的项目类型、项目名称信息,并说明与本项目之间的区别与联系)。

2. 具有高级专业技术职务(职称)的申请人或者主要参与者是否存在同年申请或者参与申请国家自然科学基金项目的单位不一致的情况;如存在上述情况,列明所涉及人员的姓名,申请或参与申请的其他项目的项目类型、项目名称、单位名称、上述人员在该项目中是申请人还是参与者,并说明单位不一致原因。

3. 具有高级专业技术职务(职称)的申请人或者主要参与者是否存在与正在承担的国家自然科学基金项目的单位不一致的情况;如存在上述情况,列明所涉及人员的姓名,正在承担项目的批准号、项目类型、项目名称、单位名称、起止年月,并说明单位不一致原因。

4. 其他。

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