黄瓜苦味物质生物合成调控相关转录因子的筛选与鉴定
张雷
【摘要】：黄瓜是一类重要的蔬菜作物,在世界上被广泛栽培。果实中积累葫芦素C会导致黄瓜苦味,严重影响黄瓜品质。从根本上真正解决黄瓜苦味问题,必须弄清楚黄瓜苦味形成的机制,才能为后续利用分子育种工具改良黄瓜品质打下坚实的科学基础。 真核生物中,转录水平的调控是基因表达调控的主要方式。本研究使用黄瓜cDNA文库,通过酵母单杂交技术筛选与苦味物质生物合成调控相关的转录因子。主要结果如下： 从华北型黄瓜9930中克隆苦味生物合成基因簇的启动子序列并构建到酵母单杂交报告载体pHIS2上。pHIlS2-BPr报告载体转化酵母Y187,获得能够消除报道基因在酵母细胞中的本底表达的最适3-AT浓度(15mM),此浓度作为后续筛选黄瓜cDNA文库的3-AT工作浓度。 使用酵母单杂交技术,对黄瓜cDNA文库进行多次筛选,共鉴定出16个转录因子,其中有4个bHLH家族、4个bZIP家族、4个AP2/ERF家族、2个MYB家族和2个锌指蛋白。候选转录因子通过恢复验证及与p450氧化酶进行一对一的激活验证,筛选出的4个转录因子可以激活黄瓜苦味物质生物合成基因簇的表达,分别是Csa3G270(bHLH)、Csa6G020(bZIP)、Csa4G970(bZIP)和Csa5G220(bHLH). 构建含有荧光素酶的报告载体和连有候选转录因子的效应载体,利用农杆菌渗透法直接转化烟草植株上的叶片,进行转录因子的瞬时表达分析。结果证明Csa3G270(bHLH)、Csa4G970(bZIP)和Csa5G220(bHLH)可以激活黄瓜苦味物质生物合成基因簇的表达。 通过原核表达纯化系统,构建原核表达载体pET32a-Csa5G220,诱导纯化Csa5G220基因表达的融合蛋白。Csa5G220基因编码251个氨基酸的蛋白,相对分子量为33KDa,理论等电点为7.54。体外用凝胶阻滞试验进一步验证纯化蛋白与其顺式作用元件的结合能力。
【关键词】：黄瓜苦味合成转录因子筛选鉴定酵母单杂交
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：S642.2
【目录】：
摘要7-8
ABSTRACT8-10
英文缩略表10-11
第一章 文献综述11-23
1 黄瓜苦味物质生物合成研究进展11-12
2 转录因子的结构与功能12-14
2.1 DNA结合区13
2.2 转录调控区13
2.3 核定位信号区13-14
2.4 寡聚化位点14
3 酵母单杂交系统14-16
3.1 酵母单杂交原理14-15
3.2 酵母单杂交在植物基因工程中的应用15-16
4 植物次生代谢物转录调控的研究进展16-20
4.1 MYB类转录因子17-18
4.2 bHLH类转录因子18-19
4.3 AP2/ERF类转录因子19
4.4 WRKY类转录因子19-20
4.5 NAC类转录因子20
5 本研究目的与意义及技术路线20-23
5.1 本研究目的与意义20-22
5.2 技术路线22-23
第二章 酵母单杂交报告载体pHIS2-BPr的构建23-31
1 材料与方法23-28
1.1 实验材料23-24
1.2 方法24-28
1.2.1 植株总DNA的提取24
1.2.2 Bi基因启动子区的PCR扩增24-25
1.2.3 目的片段的回收25
1.2.4 目的片段与载体连接25-26
1.2.5 质粒提取26
1.2.6 报告载体pHIS2-BPr的构建26-27
1.2.7 大肠杆菌的转化27
1.2.8 摸索最适3-AT浓度27-28
2 结果与分析28-30
2.1 报告载体pHIS2-BPr的构建28-29
2.2 摸索最适的3-AT浓度29-30
3 讨论30-31
第三章 与pHIS2-BPr互作的转录因子筛选与鉴定31-45
1 材料与方法31-36
1.1 实验材料31
1.2 方法31-36
1.2.1 黄瓜cDNA文库的扩增与检测31-32
1.2.2 酵母单杂交对照试验32-33
1.2.3 与pHIS2-BPr互作的转录因子筛选33
1.2.4 与pHIS2-BPr互作的转录因子分析33-34
1.2.5 与pHIS2-BPr互作的转录因子恢复验证34-35
1.2.6 黄瓜总RNA的提取与cDNA第一条的合成35
1.2.7 与pHIS2-BPr互作的转录因子构建全长验证35
1.2.8 pHIS2-p450报告载体的构建35-36
1.2.9 互作蛋白结合顺式作用元件的分析36
2 结果与分析36-43
2.1 cDNA文库的检测36
2.2 对照试验36-37
2.3 与pHIS2-BPr互作的转录因子37
2.4 pHIS2-p450报告载体的构建37-38
2.5 调控cluster的候选转录因子的构建与验证38-41
2.6 互作蛋白结合顺式作用元件的确定41-43
3 讨论43-45
第四章 候选转录因子瞬时表达分析45-55
1 材料与方法45-49
1.1 实验材料45-46
1.2 方法46-49
1.2.1 pCAMBIA1300-Luc报告载体的构建46-47
1.2.2 pCAMBIA1300-TF效应载体的构建47-48
1.2.3 农杆菌的转化48
1.2.4 烟草注射实验48-49
2 结果与分析49-53
2.1 pCAMBIA1300-Luc报告载体的构建49
2.2 pCAMBIA1300-TF效应载体的构建49-50
2.3 pCAMBIA1300-Luc和pCAMBIA1300-TF的农杆菌转化50-51
2.4 烟草注射实验51-53
3 讨论53-55
第五章 Csa5G220基因原核表达分析55-61
1 材料与方法55-58
1.1 实验材料55-56
1.2 方法56-58
1.2.1 原核表达载体pET32a-Csa5G220的构建56
1.2.2 His-Tag融合蛋白的诱导表达56-57
1.2.3 His-Tag融合蛋白的纯化57-58
2 结果与分析58-59
2.1 原核表达载体pET32a-Csa5G220的构建58
2.2 Csa5G220-His融合蛋白的诱导表达58
2.3 Csa5G220-His融合蛋白纯化58-59
3 讨论59-61
全文结论61-63
参考文献63-71
附录71-75
致谢75
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茶树类黄酮合成转录因子筛选及ANR基因功能验证
赵磊
【摘要】：茶多酚是茶树[Camellia sinensis（L.）O. Kuntze]中主要的次生代谢产物，其含量可达鲜叶和嫩茎干重的18%～36%，包括酚酸、黄酮醇、黄烷-3-醇（儿茶素）、黄酮、花青素和原花青素等。不同酚类物质的生物合成主要途径基本相同，涉及到莽草酸途径、苯丙烷类代谢途径和类黄酮合成途径。花青素还原酶（anthocyanidin reductase，ANR）是控制儿茶素和原花青素合成的直接酶类，而苯丙烷类代谢途径和类黄酮合成途径中的许多酶促反应受到转录因子R2R3-MYB, bHLH和WD40蛋白的调控。有关茶树转录因子基因功能研究几乎未见报道，茶树ANR基因的功能也不能确定。本文重点对初步测得的茶树基因组中转录因子基因进行生物信息学分析，并利用烟草遗传转化体系对茶树ANR基因功能进行验证。 主要研究内容如下： 1.初步测得的茶树基因组中转录因子R2R3-MYB, bHLH和WD40蛋白的生物信息学分析。 从茶树基因组中127,094条单一基因中筛选转录因子基因，并逐一进行保守结构域鉴定，分别筛选得到73条R2R3-MYB基因，49条bHLH基因和134条WD40基因。 为了预测基因的功能，将73条茶树R2R3-MYBs和126条拟南芥R2R3-MYBs合并到一起构建进化树。进化树结果显示，拟南芥R2R3-MYB可分为25个亚组，茶树R2R3-MYB可分成27个亚组，茶树R2R3-MYB可以整合到拟南芥的进化枝中，但是比拟南芥多两个亚组。利用MEME网站软件，对茶树R2R3-MYB亚组的基序进行了重新定义。根据进化树分支和基序推测，6条第4亚组茶树R2R3-MYB可能参与负调控酚酸代谢和单宁合成，2条第5亚组茶树R2R3-MYB可能参与调控原花青素合成，1条第7亚组茶树R2R3-MYB可能参与调控黄酮醇合成。 同样，将拟南芥和茶树bHLH放在一起构建进化树。进化树结果显示，拟南芥bHLH可以分为32个亚组，茶树bHLH分布在其中9个亚组中。参照拟南芥的功能注释，茶树中2条第2亚组bHLH、5条第24亚组bHLH蛋白可能参与调控类黄酮合成途径。 基序分析还发现，CsMYB4-1、CsMYB4-2、CsMYB4-3、CsMYB4-4、CsMYB5-1和CsMYB5-2的序列中包含[DE]Lx2[RK]x3Lx6Lx3R基序，该基序特定结合bHLH，有助于形成稳定的MYB–bHLH复合物，提示这些MYB蛋白可能与bHLH一起发挥作用。 因存在较大的进化差异，茶树WD40蛋白无法构建进化树，然而从中我们也找到1条与AtTTG1高度同源的CsWD40-1，两者序列一致性为80.4%，提示它可能参与调控类黄酮的合成。 2. R2R3-MYB, bHLH和WD40转录因子基因的克隆和表达分析。 本论文对筛选出来的转录因子基因进行了全长序列的End-to-end PCR验证，部分基因通过了RACE-PCR验证。同时通过荧光定量PCR分析（qRT-PCR）技术分析了筛选出的转录因子基因在茶树不同发育阶段和不同处理条件下，包括ABA、GA及伤害处理条件下的表达差异。并预测了在类黄酮合成途径中可能的靶结合位点。 3.茶树基因组的ANR基因启动子克隆、生物信息学及其表达分析。 在茶树基因组中查找到2条与GU944768和JN024667一致的ANR基因，并命名为CsANR1和CsANR2。进化树显示CsANR1和CsANR2与VvANR和DkANR同源性最高，蛋白结构分析CsANR1和CsANR2与葡萄ANR的晶体结构3hfsB的一致性最高，并推测了茶树ANR的NADPH结合位点、底物结合位点及催化位点。克隆得到CsANR1和CsANR2的启动子，分别有2464bp和1500bp，发现两个ANR启动子中都存在很多响应光、激素、环境胁迫的顺式作用元件。qRT-PCR技术分析了CsANR1和CsANR2在茶树不同组织和不同处理中的表达模式，结果发现，CsANR1和CsANR2在芽、四叶和根中表达量比较高；对光照和蔗糖响应明显；对激素和伤害处理响应不明显。 4.茶树CsANR1和CsANR2基因的功能验证。 转CsANR1和CsANR2烟草植物花的花色出现不同程度的变浅，其中转CsANR1的烟草花变浅明显；同时发现，转基因烟草花中的花青素含量下降，而原花青素含量升高。通过qRT-PCR对转基因烟草中类黄酮合成途径相关基因进行分析，结果发现，在转CsANR1的烟草花中，CHS、CHI、F3’H基因都被下调，其中F3’H下调最为明显，ANS基因上调最为明显。在转CsANR2的烟草花中，CHS、CHI、F3H、ANS、DFR基因的表达量明显下降，F3’H的表达量明显升高。 5.可能参与调控茶树CsANR的转录因子CsMYB5-2的功能验证。 生物信息学分析表明，CsMYB5-2与DkMYB4（BAI49721）和PtMYB115（EEE81917）的亲缘关系较为密切。转CsMYB5-2的烟草植物花中DMACA显色的原花青素含量出现明显的提高。通过qRT-PCR对转基因烟草中类黄酮合成途径相关基因进行分析，结果显示，在转CsMYB5-2的烟草花中ANR基因的表达量明显上升。
【关键词】：茶树类黄酮合成途径转录因子生物信息学分析ANR基因功能验证
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：S571.1
【目录】：
摘要3-5
Abstract5-8
目录8-10
第一章 文献综述10-19
1.1 茶树的类黄酮化合物及其生物合成途径10-14
1.2 与类黄酮合成相关的转录因子14-15
1.3 类黄酮合成途径中 ANR 基因的研究进展15-18
1.4 本研究的目的及意义18-19
第二章 茶树中与类黄酮合成相关的转录因子生物信息学分析19-44
引言19-20
1 材料和方法20-23
1.1 序列来源20
1.2 同源结构域搜索与进化树构建20
1.3 植物材料及 RNA 提取20-21
1.4 基因全长克隆及分析21-22
1.4.1 RACE PCR21-22
1.4.2 RACE-PCR 产物测序22
1.4.3 序列全长的高保真 PCR 验证22
1.5 荧光定量 PCR22-23
2 结果与分析23-39
2.1 茶树 R2R3-MYB, bHLH 和 WD40 基因的筛选23
2.2 茶树 R2R3-MYBs 的基序及分组23-29
2.3 茶树 bHLH 的分组和基序预测29-35
2.4 预测参与茶树类黄酮合成调控的 WD40 基因35-37
2.5 与茶树类黄酮合成相关的候选基因序列全长验证以及表达差异检测37-39
3. 讨论39-44
3.1 R2R3-MYB 第 4、5、7 亚组的基因筛选和功能预测39-41
3.2 bHLH 第 2、24 亚组的基因功能预测41-42
3.3 WD40 基因功能预测42-44
第三章 花青素还原酶基因的功能研究44-67
引言44-45
1 材料和方法45-50
1.1 材料45
1.2 主要仪器45
1.3 部分试剂配方45
1.4 实验方法45-50
1.4.1 茶树基因组中 ANR 基因的查找、克隆及生物信息学分析45-46
1.4.2 CsANR1 和 CsANR1 启动子序列获得及生物信息学分析46-47
1.4.3 CsMYB5-2 基因全长克隆47
1.4.4 植物表达载体的构建与转基因47-49
1.4.5 转基因烟草花花青素与原花青素测定方法49
1.4.6 转基因烟草花 RT-PCR49-50
1.4.7 茶树及转基因烟草中相关基因的荧光定量 PCR50
2 结果与分析50-64
2.1 茶树中两条 ANR 基因全长信息及进化树分析50-53
2.1.1 茶树基因组中 ANR 基因分析50-51
2.1.2 茶树 ANR 基因生物信息学分析51-53
2.2 茶树 ANR 基因启动子序列及顺式作用元件分析53-57
2.2.1 茶树 ANR 基因启动子的克隆53
2.2.2 启动子的序列的信息学分析53-57
2.3 茶树 ANR 基因的功能验证57-61
2.3.1 茶树不同组织 ANR 基因的表达差异57
2.3.2 茶树 ANR 基因的诱导表达差异57-58
2.3.3 利用烟草遗传转化体系验证茶树 ANR 基因的功能58-61
2.4 可能调控茶树 ANR 基因表达的转录因子 CsMYB5-2 的功能验证61-64
2.4.1 CsMYB5-2 基因信息学分析61-62
2.4.2 茶树不同组织 CsMYB5-2 基因的表达差异62-63
2.4.3 利用烟草遗传转化体系验证 CsMYB5-2 基因63-64
3. 讨论64-67
3.1. ANR 反应机理64-65
3.2 茶树 ANR 蛋白序列及高级结构65-66
3.3 茶树 ANR 的调控66-67
结论67-69
参考文献69-75
附件75-98
致谢98-100
作者简介及成果清单100-101
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