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基础医学
细菌性生物恐怖剂可视化基因芯片检测方法的评价
添加时间: 2016-5-27 13:49:31 来源: 作者: 点击数:1560

 

研究意义

随着我国对外贸易的快速发展,使物流、运输工具等大规模出入境态势呈强劲的增长趋势,伴随着贸易和人员来往的快速增加,境外的一些重要危险疾病和生物恐怖剂传入我国的风险也显著增强[1]。尤其是近年来,随着国家经济的迅速发展和国力昌盛,我国经常举办各种重大国际活动。在这种大规模的国际集会活动中,人群的跨国流动和高度聚集,使生物恐怖剂的输入风险和传播机会大大增加,对举办城市、交通枢纽城市和重点旅游地区的公共卫生服务和反生物恐怖工作造成空前的压力,公共卫生安全保障工作面临空前的挑战[2,3]。一旦发生生物恐怖事件,必将对我国社会稳定、人民健康和国家生物安全形成巨大冲击。

国境口岸是国家的大门,是反恐工作的前沿阵地,也是最容易遭受世界恐怖势力袭击的地方,反恐任务繁重,如广州、北京、深圳、厦门、西安等口岸曾发生64起可疑白色粉末事件,导致国际候机楼停用数日,造成一定程度的人员恐慌和局面失控。作为国家生物安全的第一道屏障,出入境检验检疫反生物恐怖工作的快速反应和正确处置,是预警恐怖风险、保障公共卫生安全和社会稳定的重要步骤,而快速反应的基础在于快速检测技术的建立,这也是当前反生物恐怖领域中迫切需要解决的关键问题之一[4,5]。目前,对于细菌性生物恐怖剂检测、鉴定手段仍停留在培养、血清和生化等水平,一些分子生物学技术由于没有成熟的产品问世,离能够远程、快速、广谱地准确鉴定生物恐怖剂还有一定的差距,导致这些技术很少应用到实际的检测鉴定工作中,只能作为常规标准检测方法的补充和辅助[6-10]

基于此,作者研制了能同时检测炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森氏菌、土拉杆菌、布鲁氏杆菌等八种生物恐怖剂的可视化基因芯片检测方法。为使该方法尽快应用到实际工作中,本课题展了对该方法的实用性、灵敏度、特异性和重复性等性能指标进行了评价。

研究现状

Cutoff值是判断芯片杂交信号是否为阳性的标准,研究通过多次重复实验,对阳性杂交信号值、阴性杂交信号值及空白对照的背景值进行了统计分析。在阳性信号值远高于阴性及空白对照信号值、以及各条探针的阴性及空白对照信号值差别不大的前提下,为了判别的方便,将各条探针的Cutoff值统一确定为10.0Cutoff值的确定为芯片灵敏度的评价提供了定量可靠的依据。

实验对各种致病菌的可视化检测特异性和灵敏度进行了系统的评价,结果表明无论是对于采用一条特异基因即能检测的鼠疫杆菌、炭疽芽孢杆菌、土拉杆菌、布鲁氏菌、伤寒沙门氏菌和痢疾志贺氏菌,还是需要两条特异基因同时鉴别才能确定的霍乱弧菌O139和大肠杆菌O157,八种致病菌的检测灵敏度均能达到103 CFU/mL,这个结果意味着每微升样本溶液中含有一个细菌即可以被检出,从而能够满足大多数情况下高灵敏度的检测要求。另外,实验选取鼠疫杆菌、痢疾志贺氏菌、伤寒菌和布鲁氏菌四种细菌对基因芯片的重复性进行了评价。结果表明该基因芯片片间和片内重复性CV%均小于15 %,显示出该方法具有良好的重复性。

通过对可视化检测八种生物恐怖剂致病菌的基因芯片检测方法评价结果可以得出:该方法能保证各条探针都具有高度特异性,芯片的片内和片间CV%小于15%,重复性良好,八种致病菌的灵敏度均能达到103CFU/mL。因此使用该检测方法可对八种重要生物恐怖剂致病菌进行快速、灵敏、高通量的检测,为突发生物恐怖袭击提供了高效的检测和甄别手段,提升了国境口岸在反生物恐怖中对细菌性生物恐怖剂的侦检能力。

参考文献

[1] 陆琳,车志军,孙福军等.国境口岸生物恐怖剂标本采集和处理方法[J].中国病原生物学杂志,2011,6(9):715-716.

[2] 车志军,陆琳,孙福军等. 国境口岸生物恐怖特征及医学现场应对要点的分析[J].中国国境卫生检疫杂志,2012,35(1):51-55.

[3]Jin D, Qi H, Chen S,et al. Simultaneous detection of six human diarrheal pathogens by using DNA microarray combined with tyramide signal amplification[J]. J Microbiol Methods,2008,75(2):365-8

[4]Bobrow MN, Harris TD, Shaughnessy KJ, et al. a novel method of signal amplification[J]. J Immunol Methods,1989,125(2):279–85

[5]Cao X, Wang Y-F, Zhang C-F, et al.Visual DNA microarrays for simultaneous detection of Ureaplasma urealyticum and Chlamydia trachomatis coupled with multiplex asymmetrical PCR[J]. Biosens Bioelectron,2006,22(3):393-8.

[6] Call DR, Borucki MK, Loge FJ. Detection of bacterial pathogens in environmental samples using DNA microarrays[J]. J Microbiol Methods,2011,53(2):235-43.

[7] Gong H, Cradduck M, Cheung L, et al. Development of a near-infrared fluorescence ELISA method using tyramide signal amplification[J]. Anal Biochem,2012, 426(1):27-9.

[8] Meany DL, Hackler L Jr, Zhang H,et al. Tyramide signal amplification for antibody-overlay lectin microarray: a strategy to improve the sensitivity of targeted glycan profiling[J]. J Proteome Res, 2011,10(3):1425-31.

[9] Deng Z, Ge Y, Cao Q, et al. The detection of a transgenic soybean biochip using gold label silver stain technology[J]. Bioorg Med Chem Lett,2011,21(22):6905-8.

[10] Qi HJ, Chen SH, Zhang ML, et al. DNA microarrays for visual detection of human pathogenic microorganisms based on tyramine signal amplification coupled with gold label silver stain[J]. Anal Bioanal Chem,2010,398(6):2745-50.

研究内容

对细菌性生物恐怖剂可视化基因芯片检测方法从灵敏度、特异性、重复性等方面进行综合评价。对检测炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森氏菌、土拉杆菌、布鲁氏菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157H7、痢疾杆菌、霍乱弧菌等8种细菌性生物恐怖剂可视化基因芯片检测方法进行综合评价。

菌株

所用菌株如伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌O157H7、炭疽芽孢杆菌、鼠疫杆菌、土拉杆菌、布鲁氏菌等致病菌由军事医学科学院提供。菌种名称及标准菌株号见表4-1

 

仪器及试剂

iCycler PCR仪(Bio-Rad公司)、GenePix 4000B扫描仪(Axon公司)、PixSys 5000点样仪(Cartesian公司)、8909DNA合成仪(ABI公司)、DU640紫外分光光度计(Beckman公司)。PCR相关试剂购自宝生物(大连)有限公司,基因芯片片基购自CEL Associates公司,Streptavidin-HRP购自Sigma公司,Streptavidin-Nanogold购自Nanoprobes公司,Tyramine-Cy3试剂购自PE公司,Tyramine-Biotin 试剂、Nanogold-DAB试剂和银增强试剂由本实验室制备。

基因芯片性能评价

特异性评价

选取靶致病菌的标准菌株及相关近源属和远源属的标准菌株通过通用引物多重PCR扩增后,与筛选得到的多种致病菌检测探针杂交,对基因芯片上各个探针的特异性进行系统评价。

灵敏度评价

各种烈性致病菌的灵敏度标准品由中国药品与生物制品检定所和军事医学科学院微生物与流行病研究所提供,用生理盐水将标准品进行10倍梯度稀释后,参照基因组DNA提取步骤,处理DNA,待用。

重复性评价

选取鼠疫、痢疾、伤寒和布氏四种细菌对基因芯片重复性进行评价。进行重复性实验,在不同批次点样的基因芯片中随机选取三批作为检测目标;再从中不同的三批芯片中随机抽取三个芯片,将经多重PCR扩增和基因芯片杂交获得的检测结果进行统计学分析,进而评价芯片的重复性。

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