Parkin基因过表达质粒和细胞模型的构建

[1]Parkin基因过表达质粒和细胞模型的构建

马浩洁¹ 冯琬迪¹ 盖聪¹ 强天遥¹ 张淑静² 胡京红² 高誉珊²

毛颖秋³  郭振宇¹ 孙红梅^1△

（1北京中医药大学中医学院解剖教研室 北京 100029； 2北京中医药大学中医学院科研中心 北京 100029；3北京中医药大学中医药研究院 北京 100029）

摘要 目的：构建Parkin基因过表达质粒并转染SH-SY5Y细胞，为进一步研究帕金森病的发病机制及中药的作用环节奠定基础。方法：首先构建Parkin基因过表达质粒，采用脂质体转导技术，将Parkin过表达质粒应用Lipo3000转染SH-SY5Y细胞。荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白的表达；RT-PCR检测其Parkin mRNA的表达；Western Blot技术检测其Parkin蛋白的表达。结果：转染组可观测到较多的绿色荧光蛋白表达；Parkin过表达细胞Parkin mRNA和蛋白的表达均显著提高（P＜0.01）。结论：通过脂质体转导技术，应用Lipo3000可将Parkin过表达质粒成功转染入SH-SY5Y细胞，转染的基因和蛋白表达均较高，提示此法可成功构建Parkin基因过表达的细胞模型。

关键词：帕金森病；Parkin；SH-SY5Y细胞；质粒；转染

[中图分类号] R742.5

Construction of Parkin overexpression plasmid

and the cell model

MA Hao-jie¹, FENG Wan-di¹, GAI Cong¹, QIANG Tian-yao¹, ZHANG Shu-jing²,

 HU Jing-hong², GAO Yu-shan², MAO Ying-qiu³, GUO Zhen-yu¹, SUN Hong-mei^1△

（1 Department of Anatomy, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing, 100029; 2 Department of scientific research center, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing, 100029; 3 Chinese traditional medicine research institute, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing, 100029）

 [Abstract] Objective Construct Parkin overexpression plasmid and transfect into human neuroblastoma SH-SY5Y cells, and to lay a foundation for studying the pathogenesis of Parkinson's disease and the role of traditional Chinese medicine. Methods Firstly construct Parkin overexpression plasmid. Using liposome transduction technology, the Parkin overexpression plasmid was transfected into SH-SY5Y cells by lipo3000. The green fluorescent protein was observed by fluorescence microscopy; RT-PCR technique was used to detect the expression of Parkin at mRNA level; Western-blot technique was used to detect the expression of Parkin at protein level. Results More expression of enhanced green fluorescent protein(EGFP) was observed in the transfected group; the mRNA and protein expression of Parkin was significantly increased after transfection with Parkin overexpression plasmid (P<0.01). Conclusions Using liposome transduction technology, the Parkin overexpression plasmid was successfully transfected into SH-SY5Y cells by lipo3000, the mRNA and protein expression of Parkin was significantly increased. So the cell model of Parkin gene overexpression was successfully established.

Key Words: Parkinson’s disease, Parkin, SH-SY5Y cell, plasmid, transfect

Chinese Library Classification (CLC):R742.5

帕金森病(Parkinson' s disease，PD)，是一种以中脑黑质多巴胺能神经元变性、丢失为主要病变的慢性神经退行性疾病^[1]。目前其发病机制尚不明确，研究发现遗传、环境和老龄化等因素均与PD的发病相关。迄今为止，已经命名并确定与PD相关的易感基因有18个，其中Parkin作为重要的PD相关基因越来越被关注和重视。故本实验将设计Parkin过表达质粒并转染SH-SY5Y细胞，拟构建Parkin基因过表达的细胞模型，为进一步研究Parkin基因在帕金森病中的作用以及中药对它的干预作用奠定基础。

1材料和方法

1.1材料、试剂

人神经母细胞瘤细胞 SH-SY5Y 细胞株购自上海吉凯基因化学技术有限公司；Parkin质粒由上海吉凯基因科技有限公司构建，同时提供阴性对照菌液及质粒；DMEM高糖培养基、澳洲来源胎牛血清、青霉素-链霉素溶液(100X)、胰酶细胞消化液、Lipofectamine®3000转染试剂、TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；PBS购自美国HyClone公司；硫酸卡那霉素购自瑞士Genebio公司；QIAGEN质粒大提试剂盒购自美国QIAGEN公司；逆转录试剂盒购自美国Thermo Scientific公司；THUNDERBIRD qPCR定量检测试剂购自日本TOYOBO公司；预染蛋白Marker购自美国Thermo公司；BCA蛋白定量试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；Parkin Antibody购自美国Abcam公司；Peroxidase Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 购自中杉金桥公司；Beta Actin Antibody购自美国Proteintech公司；30%丙烯酰胺-双丙烯酰胺、分离胶缓冲液(含有SDS)，浓缩缓冲液(含有SDS)、电泳缓冲液、电转缓冲液、蛋白电泳上样缓冲液、脱脂奶粉、TBST、ECL超敏发光液均购自北京普利莱技术有限公司；25cm²细胞培养瓶、细胞培养板、离心管购自美国Corning公司。

1.2仪器

二氧化碳培养箱（日本SANYO），高速冷冻离心机（美国Thermo公司），倒置式荧光显微镜（Nikon TE2000，日本），超净工作台（北京昌平长城空气净化工程公司），Safire2全波长荧光酶标仪（瑞士TEcan公司），紫外分光光度仪（美国Bio-Rad公司），SANYO超低温冰箱（日本SANYO），ABI7500实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司），SANYO SIM-F124制冰机（日本SANYO），SZ-96自动纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂），Western bolt电泳槽和电转槽（美国BIO-RAD公司），WH861旋涡混合器（江苏太仓鹿河生化仪器厂），TS-1型摇床（江苏海门市麒麟医用仪器厂），移液器（德国Eppendorf公司）。

2 方法

2.1 质粒构建、转化、扩增、提取及鉴定

带有绿色荧光蛋白（GFP）标记的Parkin过表达质粒（人）的构建：利用限制性内切酶消化获得线性化载体，PCR 扩增制备Parkin基因片段，所用扩增引物需在其5’端添加同源重组序列，使用该引物扩增Parkin基因片段，扩增产物5’和3’最末端的序列分别与线性化载体两末端序列完全一致。以线性化载体和Parkin基因扩增产物配制反应体系，进行重组反应，实现体外环化。

对重组产物进行转化扩增：配置LB肉汤培养基及含AGAR的培养液，并接种阴性对照菌液和Parkin过表达菌液，于培养皿中并倒置于37℃培养箱中孵育16h左右；然后各挑取一个独立的、圆形且大小适中的菌落，接种于5ml含抗生素的LB培养液中，37℃，250rpm，摇菌10h；从两种5ml的菌液中各取1ml分别加入至LB培养液中，37℃，250rpm，摇菌14h。扩增结束后按照QIAGEN质粒大提试剂盒指南对质粒进行提取。提取的Parkin过表达质粒和阴性对照质粒，由北京鼎国公司进行测序，配置质粒测序反应体系，测序使用的引物如下：

经PCR循环条件反应后将测序产物纯化、电泳后，我们将测序结果与目的基因序列进行比对分析。

2.2 质粒转染及观察

2.2.1 细胞培养

用25cm²细胞透气培养瓶，含有10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM完全培养基培养SH-SY5Y细胞，培养条件为：37℃、5%CO₂、95%空气条件。每1～2天进行换液，细胞长至80%～90%时传代：①用吸管吸出旧的培养基，PBS清洗2次，每次5ml，每瓶加入0.5ml胰酶，消化30～60s，显微镜下观察大部分细胞收缩、变圆，有少许细胞开始掉落时，立即用吸管吸出胰酶，加入5ml培养基吹打终止消化，使细胞从瓶壁上全部脱落，悬浮在培养基中；②将细胞悬液转移至15ml离心管中，4℃，1000rpm，离心5min；③弃上清，新鲜培养液重悬细胞并轻轻混匀，根据细胞生长密度选择传代瓶数。一周传代2～3次。细胞冻存时，冻存液成分：70%培养基，20%胎牛血清，10%DMSO；冻存密度为1～2×10⁶个/管，液氮保存。

2.2.2 实验分组

实验分为三组（1）正常对照组（C）：正常培养SH-SY5Y细胞；（2）阴性对照组（NC）：SH-SY5Y细胞转染阴性对照质粒；（3）Parkin过表达组（PC）：SH-SY5Y细胞转染Parkin过表达质粒。

2.2.3 转染

细胞铺板24h后，按照Lipofectamine® 3000说明书用其进行转染。转染48h后，荧光显微镜下观察其GFP的表达情况。

2.3 实时荧光定量PCR （RT-PCR）检测EGFP-Parkin mRNA的表达水平

2.3.1 提取RNA及将RNA逆转录为cDNA

实验分组及处理同2.2，TRIzol提取细胞后每管加入200μl氯仿，离心15min后吸取400μl上层水相至新的管中；每管加入400μl异丙醇，离心10min，弃上清；加入l ml 75%的乙醇悬浮沉淀后离心5min，弃上清后晾置并加入50μl DEPC水，吹打混匀，稀释后用紫外分光光度计测定RNA的浓度。各组取2μg RNA与1μl 的Oligo(dT)及DEPC水混合均匀，放置于逆转录仪中变性，65℃，5min；配制反应混合物（每管：5× Reaction Buffer:4μl, RiboLock RNase Inhibitor: 1μl, 10nM dNTP Mix: 2μl, RevetAid M-Mulv RT: 1μl）每管加入8μl混合物；置于逆转录仪中反应，反应条件为42℃，60min→70℃，5min→ 4℃，-20℃保存备用。

2.3.2 PCR反应检测EGFP-Parkin mRNA表达水平

用DEPC水将cDNA稀释10倍；分别配制Parkin和β-actin引物的反应体系（见下表2），先加入引物反应混合液，每孔18μl，再加入稀释的cDNA，每孔2μl，置于实时荧光定量PCR仪内进行检测。采用Livak(2^-ΔΔCT)法分析Parkin的相对表达量：△CT = CT_Parkin-CT_β-actin，△△CT = △CT_实验组 - △CT_对照组，相对表达量 = 2^-△△CT。

（1）       Parkin及β-actin引物序列如下：

（2）Parkin和β-actin引物的每孔反应体系如下：

（3）RT-PCR运行条件为：95℃ 15s, 61℃ 30s, 72℃ 4min  40个循环

2.4  Western Blot检测Parkin蛋白的表达水平

2.4.1蛋白提取、定量及变性

按BCA蛋白定量试剂盒提取蛋白并检测蛋白浓度。提取的蛋白样品加入5×loading buffer和RIPA蛋白裂解液进行定量配平，并将配平的蛋白样品置于100℃沸水浴中煮5min。

2.4.2免疫印迹

配胶、灌胶：配制10ml 10%的分离胶和5ml 5%的浓缩胶，先后灌入，先配分离胶，再配制浓缩胶，然后插入10孔梳子，待浓缩胶凝固后，将梳子拔出，置于电泳槽中；开始上样每孔30µg，20µl，上样后100V电压，电泳约120min。电泳结束后，转膜，制作“三明治”夹板并将其放入电转槽中并加满电转液；电转槽置于冰上开始电转，100V电压，电转80min。电转后将膜取出，室温下置于摇床上封闭1h。一抗孵育：用一抗稀释液将一抗稀释至适当浓度（1：1000）；室温下，摇床上孵育1h后，置于4°冰箱里孵育过夜。二抗孵育：摇床上用TBST将膜漂洗15min×3次。用0.5%脱脂牛奶-TBST溶液稀释二抗至适当的浓度（1：1000）置于摇床上慢速摇动孵育1h；将膜取出，置于摇床上用TBST漂洗15min×3次。曝片、洗片并将图片进行扫描，采用Quantity One-4.6.2软件进行分析。

3 统计方法

实验数据采用均值±标准差（`x ± s）表示，应用SPSS20.0统计软件中的单因素方差分析（One-way ANOVA）对数据进行处理，以P<0.05时，差异具有统计学意义，P<0.01时差异性显著。

结果

1 质粒构建、转化、提取及测序结果

构建的EGFP-Parkin(NM-004562)过表达质粒其结构见图1，转化、扩增和提取，所提取质粒的浓度如表1。

图1  构建的Parkin过表达质粒载体结构图

Fig. 1  The structure of Parkin overexpression plasmid

GV146：载体编号；CMV-MCS-IRES-EGFP-SV40-Neomycin：元件顺序；EGFP：荧光标记；Kan^r：青霉素抗性；MCS：多克隆位点(Parkin)。

GV146：the carrier number；CMV-MCS-IRES-EGFP-SV40-Neomycin：component order；EGFP：fluorescent marker；Kan^r：penicillin resistance；MCS：multiple cloning site(Parkin)

表1  提取质粒的浓度

                Table 1  The concentration of the extract plasmid          

北京鼎国公司对其进行测序，我们将测序的结果与目的基因Parkin序列与所提供的对比如下：

AGCAATAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCTCGAGCGCCACCATGATAGTGTTTGTCAGGTTCAACTCCAGCCATGGTTTCCCAGTGGAGGTCGATTCTGACACCAGCATCTTCCAGCTCAAGGAGGTGGTTGCTAAGCGACAGGGGGTTCCGGCTGACCAGTTGCGTGTGATTTTCGCAGGGAAGGAGCTGAGGAATGACTGGACTGTGCAGAATTGTGACCTGGATCAGCAGAGCATTGTTCACATTGTGCAGAGACCGTGGAGAAAAGGTCAAGAAATGAATGCAACTGGAGGCGACGACCCCAGAAACGCGGCGGGAGGCTGTGAGCGGGAGCCCCAGAGCTTGACTCGGGTGGACCTCAGCAGCTCAGTCCTCCCAGGAGACTCTGTGGGGCTGGCTGTCATTCTGCACACTGACAGCAGGAAGGACTCACCACCAGCTGGAAGTCCAGCAGGTAGATCAATCTACAACAGCTTTTATGTGTATTGCAAAGGCCCCTGTCAAAGAGTGCAGCCGGGAAAACTCAGGGTACAGTGCAGCAcCTGCAGGCAGGCAACGCTCACCTTGACCCAGGGTCCATCTTGCTGGGATGATGTTTTAATTCCAAACCGGATGAGTGGTGAATGCCAATCCCCACACTGCCCTGGGACTAGTGCAGAATTTTTCTTTAAATGTGGAGCACACCCCACCTCTGACAAGGAAACATCAGTAGCTTTGCACCTGATCGCAACAAATAGTCGGAACATCACTTGCATTACGTGCACAGACGTCAGGAGCCCCGTCCTGGTTTTCCAGTGCAACTCCCGCCACGTGATTTGCTTAGACTGTTTCCACTTATACTGTGTGACAAGACTCAATGATCGGCAGTTTGTTCACGACCCTCAACTTGGCTACTCCCTGCCTTGTGTGGCTGGCTGTCCCAACTCCTTGATTAAAGAGCTCCATCACTTCAGGATTCTGGGAGAAGAGCAGTACAACCGGTACCAGCAGTATGGTGCAGAGGAGTGTGTCCTGCAGATGGGGGGCGTGTTATGCCCCCGCCCTGGCTGTGGAGCGGGGCTGCTGCCGGAGCCTGACCAGAGGAAAGTCACCTGCGAAGGGGGCAATGGCCTGGGCTGTGGGTTTGCCTTCTGCCGGGAATGTAAAGAAGCGTACCATGAAGGGGAGTGCAGTGCCGTATTTGAAGCCTCAGGAACAACTACTCAGGCCTACAGAGTCGATGAAAGAGCCGCCGAGCAGGCTCGTTGGGAAGCAGCCTCCAAAGAAACCATCAAGAAAACCACCAAGCCCTGTCCCCGCTGCCATGTACCAGTGGAAAAAAATGGAGGCTGCATGCACATGAAGTGTCCGCAGCCCCAGTGCAGGCTCGAGTGGTGCTGGAACTGTGGCTGCGAGTGGAACCGCGTCTGCATGGGGGACCACTGGTTCGACGTGTAGCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTACG

比对结果说明：所测得Parkin过表达质粒序列与所提供的对比序列完全一致。

2 转染后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达

荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光蛋白（GFP）的表达。结果显示，阴性对照组和Parkin过表达组细胞内可观察到较多的绿色荧光蛋白表达，而正常组细胞没有观察到，提示质粒成功转染至细胞内。结果见图2。

 图2  A：正常对照组（明场）；B：正常对照组（暗场）；C：阴性对照组（明场）；D：阴性对照组（暗场）；E：Parkin过表达组（明场）；F：Parkin过表达组（暗场）

Fig. 2 A:Normal control(bright field); B: Normal control(dark field); C:Negative control(bright field); D:Negative control(dark field); E:Parkin overexpression(bright field); F:Parkin overexpression(dark field)

3 转染后SH-SY5Y细胞内Parkin mRNA表达情况

荧光定量PCR（RT-PCR）结果显示，Parkin过表达质粒转染后，正常对照组与阴性对照组的Parkin mRNA水平没有明显差异（P>0.05）；而与正常对照组和阴性对照组相比，Parkin对照组的Parkin mRNA表达量有明显提高（P<0.01），结果表2和图3。

另外，RT-PCR的溶解曲线（Melt Curve）分析结果显示，Parkin扩增产物的特异性良好，40个扩增循环中没有引物二聚体的产生，溶解峰为79.16℃。

表2  Parkin的相对表达量（`x ± s; n=3）

              Table 2  The relative expression of Parkin at mRNA level（`x ± s;n=3）

注：与正常对照组比较，^**P＜0.01；与阴性对照组比较，^##P＜0.01

图3  Parkin过表达质粒转染后SH-SY5Y细胞Parkin mRNA的相对表达情况

Fig.3 The relative expression of Parkin at mRNA level in the transfection of SH-SY5Y cells A：RT-PCR的扩增曲线  B：溶解曲线  C：采用2^-ΔΔCT法分析各组Parkin mRNA的相对表达量，与正常对照组比较，^*P＜0.05；与阴性对照组比较，^#P＜0.05

A: The amplification curve of RT-PCR  B: Melt curve  C: The relative expression of Parkin at mRNA level, Compared with the normal control, ^*P＜0.05; Compared with the negative control ,^#P＜0.05

4  Western Blot法检测转染后SH-SY5Y细胞内Parkin蛋白的表达水平

Western Blot结果显示，正常对照组与阴性对照组的Parkin蛋白表达水平没有明显差异（P>0.05）；Parkin过表达组的Parkin蛋白水平较正常对照组和阴性对照组有显著提高（P<0.01），提高了约60%。结果见表3和图4。

  表3  Parkin蛋白的相对表达水平（`x ± s; n=3）

Table 3  The relative expression of Parkin at protein level（`x ± s; n=3）

注：与正常对照组比较，^** P＜0.01；与阴性对照组比较，^##P＜0.01

图4  Parkin过表达质粒转染后SH-SY5Y细胞内Parkin蛋白的相对表达情况：与正常对照组比较，^**P＜0.01；与阴性对照组比较，^##P＜0.01

Fig.4 The relative expression of Parkin at protein l, evel in the transfection of SH-SY5Y cells: Compared with the normal control, ^**P＜0.01; Compared with the negative control , ^##P＜0.01

讨论   

Parkin基因，又称PARK2，最早是由Matsumine等人^[2]于1997年研究日本13个常染色体隐性遗传性青少年型PD家系时发现的。后研究发现Parkin作为帕金森病的遗传易感基因之一，其突变和蛋白功能缺陷可导致PD^[3-6]。Parkin蛋白属于E3泛素连接酶（ubiquitin-proteasome, Ub）的环指结构家族^[7]，主要功能区为RING1-IBR-RING2环，作为细胞内重要的监视系统，能及时地清除或降解细胞内发生错误折叠或功能异常的蛋白质，从而维持细胞内稳态，起到保护细胞的作用^[8]。早期的研究发现，Parkin蛋白在中脑的黑质和蓝斑处的神经元表达丰富，而帕金森病人黑质的Parkin含量明显降低，提示Parkin可能在这些区域的神经元中发挥重要作用^[9-10]。此外，研究发现，Parkin在维持线粒体质量方面发挥着重要的作用^[11]。可以与线粒体DNA直接结合，并激发线粒体自我修复过程^[12]。Parkin突变患者线粒体的功能和形态严重受损；Parkin基因敲除可出现了线粒体形态的异常和功能紊乱^[13-15]。因此，Parkin成为目前帕金森病研究热点之一。对Parkin的进一步研究，尤其是对它的作用方式和功能的研究，在有助于阐明帕金森病的发病机制的同时，也为临床新治疗靶点的发现提供实验依据。人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 细胞系是一种分化程度较低的肿瘤细胞，繁殖快，其细胞形态、生理和生化特性与多巴胺神经元相似，被广泛应用于神经系统疾病发病机制和药物作用机制方面的研究。故本实验选此细胞，旨在构建Parkin基因过表达的细胞模型, 为进一步研究Parkin基因在帕金森病中的作用奠定基础。

基因转染技术是将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内，并在细胞内表达。转染的方法有很多，根据不同的细胞，贴壁或悬浮等可选用不同的方法，主要有物理介导、化学介导和生物介导三类途径。由于物理介导途径和化学介导中的磷酸钙法实验条件控制较严、难度较大，病毒法的前期准备较复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，而且可能对细胞有较大的影响，在一般实验室中很难普及。因此本实验采用脂质体法进行瞬时转染，适用性广，重复性好^[16-17]。本研究选用Lipofectamine® 3000转染试剂，通过脂质体包裹DNA转导技术将Parkin过表达质粒转染入SH-SY5Y细胞。带正电的阳离子脂质体作为体内外输送载体的工具，可与带负电的DNA结合，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞作用被导入细胞中，转导细胞相对无害，重复性较好。转染完成之后，通过荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白表达情况，实时荧光PCR和Western Blot技术检测Parkin mRNA和蛋白的表达水平，从而对转染的效果进行鉴定。实验结果显示，转染的两组细胞可观测到较多的绿色荧光蛋白表达，而正常组细胞没有检测到荧光蛋白；另外，正常对照组和阴性对照组在Parkin的mRNA和蛋白水平的表达均没有明显差异（P＞0.05）；而与正常对照组和阴性对照组相比，转染Parkin过表达质粒后，SH-SY5Y细胞内的Parkin mRNA和蛋白的表达都显著提高（P＜0.05），提示Parkin过表达质粒转染SH-SY5Y细胞成功，表明此法可成功构建Parkin过表达细胞模型，为进一步的实验奠定了基础。

本课题组近年来致力于从线粒体基因及相关基因调控的角度探求中医药防治帕金森病的作用环节，已成功构建神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶(MPP⁺) 诱导的PD细胞模型和DJ-1基因过表达PD细胞模型，并探讨了中药复方的作用机制^[18-20]。和本实验成功构建了Parkin基因过表达细胞模型，为本课题组进一步探索Parkin在 PD 的发病中对线粒体形态和功能的影响，以及中医药防治PD 的分子机制提供了可靠的实验基础。

参考文献

[1] Xiong P, Chen X, Zhang N. Advance in studies on pathological mechanism of Parkinson’s disease and traditional Chinese medicine experiments in prevention and treatment of Parkinson’s disease[J]. Chin J Chin Mater Med, 2012, 37(5):686-691

[2] Matsumine H, Shimoda MS, et al. Localization of a gene for an autosomal recessive form of juvenile Parkinsonism to chromosome 6q25.2-27[J]. Am J Hum Genet, 1997, 60(3): 588-596

[3] Delamarre A, Meissner WG. Epidemiology, environmental risk factors and genetics of Parkinson's disease[J]. Presse Med, 2017, 46(2): 175-181

[4] Walden H, Muqit MM. Ubiquitin and Parkinson's disease through the looking glass of genetics[J]. Biochem J, 2017, 474(9): 1439-1451

[5] Pickrell AM, Youle RJ. The roles of PINK1, parkin, and mitochondrial fidelity in Parkinson's disease[J]. Neuron, 2015, 85(2): 257-273

[6] Marjan S, Guennadi Kozlov, Kalle Gehring. Parkin structure and function[J]. FEBS Journal, 2015, 282(2015): 2076-2088

[7] Ziviani E, Tao RN, Whitworth AJ. Drosophila parkin requires PINK1 for mitochondrial translocation and ubiquitinates mitofusin[J]. Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 2010, 107: 5018-5023

[8] Chakraborty J, Basso V, Ziviani E. Post translational modification of Parkin[J]. Biol Direct, 2017, 12(1): 1-11

[9] Dalfo E, Portero OV, Ayala V, et al. Evidence of oxidative stress in the neocortex in incidental Lewy body disease[J]. J Neuropathol Exp Neurol, 2015, 64: 816-830

[10] Ham SJ, Lee SY, Song S, et al. Interaction between RING1(R1) and the Ubiquitin-like (UBL) Domains Is Critical for the Regulation of Parkin Activity[J]. J Biol Chem, 2016, 291(4): 1803-1816

[11] Rüb C, Wilkening A, Voos W. Mitochondrial quality control by the Pink1/Parkin system[J]. Cell Tissue Res, 2017, 367(1): 111-123

[12] Rothfuss O, Fischer H, Hasegawa T, et al. Parkin protects mitochondrial genome integrity and supports mitochondrial DNA repair[J]. Hum Mol Genet, 2009, 18(20): 3832-3850

[13] Pacelli C, De Rasmoa D, Signorile A, et al. Mitochondrial defect and PGC-1α dysfunction in parkin-associated familial Parkinson’s disease[J]. Biochim Biophys Acta, 2011, 1812: 1041-1053

[14] Greene JC, Whitworth AJ, Andrews LA. Genetic and genomic studies of Drosophila parkin mutants implicate oxidative stress and innate immune responses the proapoptotic function of Bax[J]. Hum Mol Genet, 2005, 14: 799-811

[15] Müftüglu M, Elibol B, Dalm Inodot. Mitochondrial complex I and IV activities in leukocytes from patients with parkin mutations[J]. Mov Disord, 2003, 19(5): 544-548

[16] 卢莎,谭文杰,张玲,等. 脂质体转染法与电转染法在丙型肝炎病毒RNA转染人肝癌细胞中的应用效果比较[J]. 山东医药, 2016,56(19): 15-18

 Lu Sha, Tan Wen-Jie, Zhang Ling, et al. The application effect of liposomes transfection and electrotransfer in HCC cells was compared[J]. Shandong Medical Journa, 2016,56(19): 15-18

[17] Lu J, Xiang Y, Tao WY, et al. A novel strategy to develop a robust infectious hepatitis C virus cell culture system directly from a clinical isolate[J]. J Virol, 2014,88(3): 1484-1491

[18] 马凌,孙红梅,龚小钢,等. 牵正散合大补阴丸对MPP⁺诱导的SH-SY5Y细胞帕金森病模型线粒体的保护作用[J]. 世界中西医结合杂志, 2015,10(4): 487-492

 Ma Ling, Sun Hong-mei , Gong Xiao-Gang, et al. Protective Effect of Dabuyin Wan plus Qianzheng San on Mitochondria in SH-SY5Y Cells in Parkinson’s Disease Model[J]. The world's integrated western medicine journal, 2015,10(4): 487-492

 [19] Yi Zhang, Xiao-Gang Gong, Zhen-Zhen Wang, et al. Protective effects of DJ-1 medicated Akt phosphorylation on mitochondrial function are promoted by Da-Bu-Yin-Wan in 1-methyl-4-phenylpyridinium-treated human neuroblastoma SH-SY5Y cells[J]. Journal of Ethnopharmacology,2016, 187:83-93

[20] Yi Zhang, Xiao-Gang Gong, Zhen-Zhen Wang, et al. Overexpression of DJ-1/PARK7, the Parkinson’s disease-related protein, improves mitochondrial function via Akt phosphorylation on threonine 308 in dopaminergic neuron-like cells[J]. European Journal of Neuroscience,2016,43(10) :1379–1388