附注说明：
项目名称：外源性多胺恢复老龄大鼠心肌缺血预适应保护作用的机制研究
词
冠心病;心肌梗死
英 文 关 键 词
aa;bb
国家自然科学基金申请书 2014 版
第 3 页 版本 1.004.984
中 文 摘 要
(限400字)：：缺血预适应（IPC）是缺血心肌保护的重要内源性机制，但老龄心肌对IPC刺激减敏，具体机制不清。多胺具有广泛的生物学功能，最新研究发现其可通过诱导自噬发挥抗衰老作用。已知老龄心肌多胺减少且自噬能力降低。前期我们已证实，缺血-再灌注（IR）心肌多胺减少，外源性精胺具有保护作用；多胺是介导成年大鼠IPC心肌保护的信号分子。据此，我们推测“外源性多胺可能通过诱导自噬恢复老龄心肌IPC保护作用”。本课题首先观察不同鼠龄大鼠IPC心肌的多胺代谢，同时观察外源性多胺恢复老龄心肌IPC保护作用的能力并探讨其机制。重点关注其对自噬、线粒体损伤及凋亡的影响。再给予调控自噬和mPTP开放干预，拟证明多胺发挥作用依赖的信号级联。进一步应用分离的老龄心肌细胞及线粒体确定多胺作用的效应靶点。本课题首次在器官、细胞及分子水平上探讨多胺代谢、细胞自噬在老龄心肌IPC保护中的作用及机制，为老龄心肌IR损伤的防治提供新思路
英 文 摘 要
(限3000 Characters)：aa
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项目组主要参与者（注: 项目组主要参与者不包括项目申请人）
编号
姓 名
出生年月
性别
职 称
学 位
单位名称
电话
电子邮箱
项目分工
每年工作时间（月）
1
王一
1956-2-1
男
教授
博士
广州中医药大学
020-36591343
science1343@163.com
研究设计
8
2
王三
1969-5-5
男
教授
博士
广州中医药大学
020-36591343
science1343@163.com
心肌细胞培养
6
3
王四
1992-1-1
女
医师
硕士
广州中医药大学
020-36591343
science1343@163.com
线粒体功能测定
9
4
王五
1966-6-6
男
高级统计师
硕士
中山大学
020-36591343
science1343@163.com
统计分析
9
5
王六
1995-1-1
女
硕士生
学士
广州中医药大学
020-36591343
science1343@163.com
动物实验
10
6
[在此录入修改]
7
[在此录入修改]
8
[在此录入修改]
9
[在此录入修改]
总人数
高级
中级
初级
博士后
博士生
硕士生
6
4
1
1
说明: 高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请人负责填报（含申请人），总人数由各分项自动加和产生。
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经费申请表 （金额单位：万元）
科目
申请经费
备注（计算依据与说明）
一.研究经费
55.5000
1.科研业务费
8.5000
（1）测试/计算/分析费
2.5000
激光扫描共聚焦、Real time PCR与流式细胞仪等检测，图像处理与分析
（2）能源/动力费
1.5000
水电费
（3）会议费/差旅费
2.5000
参加国内学术会议
（4）出版物/文献/信息传播费
2.0000
文献检索、论文发表费
（5）其他
2.实验材料费
47.0000
（1）原材料/试剂/药品购置费
40.0000
购买试剂、试剂盒、抗体、合成siRNA、购买引物及所有实验用耗材
（2）其他
7.0000
购买实验动物及动物饲料费，购置高效液相色谱柱，氧电极等消耗性仪器配件支出
3.仪器设备费
0.0000
（1）购置
0.0000
（2）试制
0.0000
4.实验室改装费
5.协作费
二.国际合作与交流费
7.5000
1.项目组成员出国合作交流
4.0000
到国外开会及去国外实验室交流学习支出
2.境外专家来华合作交流
3.5000
请国外专家来实验室交流
三.劳务费
3.5000
直接参加项目研究的研究生、博士后的劳务费用
四.管理费
3.5000
不得超过申请经费的5%
合 计
70.0000
与本项目相关的 其他经费来源
国家其他计划资助经费
其他经费资助（含部门匹配）
其他经费来源合计
0.0000
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申请者在撰写报告正文时，请遵照以下要求：
1、请先选定"项目基本信息"中的"资助类别"，再填写报告正文；
2、在撰写过程中，不得删除系统已生成的撰写提纲（如误删可点击“查看报告正文撰写提纲”按钮，通过"复制/粘贴"恢复）；
3、请将每部分内容填写在提纲下留出的空白区域处；
4、对于正文中出现的各类图形、图表、公式、化学分子式等请先转换成JPG格式图片，再粘贴到申请书正文相应位置
5、本要求将作为申请书正文撰写是否规范的评判依据，请遵照要求填写。
查看报告正文撰写提纲 报告正文
报告正文：参照以下提纲撰写，要求内容翔实、清晰，层次分明，标题突出。
（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）：
1．项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）；
（1）老龄心肌缺血/再灌注（IR）损伤与缺血预适应（IPC）保护
人口老龄化是当今世界一个突出性的社会问题，我国人口老龄化发展速度尤其之快。提高老年人的生活质量，已经成为全社会研究的重要课题。冠心病是引起老年人死亡的最常见原因，其基本病理生理过程是心肌缺血，尽早恢复缺血心肌的血液供应能够挽救缺血心肌，但再灌注引起缺血/再灌注损伤（ischemia/reperfusion injury, IRI）。 缺血预适应（ischemic preconditioning, IPC）是心肌保护的新概念，是迄今为止最强的内源性心肌缺血保护方法。但由于老龄心肌细胞发生退行性变，心肌细胞自噬能力降低，线粒体功能下降（mtDNA突变），氧化应激增强，老龄导致内源性保护物质的生成减少以及IR损伤中发重要作用的蛋白质（膜受体、下游的激酶、磷酸酶、促炎细胞因子等）表达/活性发生改变等，导致老龄心肌对缺血预适应刺激的敏感性减弱或消失【1,2】。因此，迫切需要有效的措施改善或恢复老龄心肌对缺血预适应刺激的敏感性，提高老龄心肌抗缺血损伤的能力，进而提高老年人的生存率。
（2）多胺代谢
带有多价正电荷的小分子多胺（polyamine, PAs）包括精胺（spermine, SP）, 精脒（spermidine, SPD）及腐胺（putrescine, PU），广泛存在于迄今人们所研究的所有真核细胞和原核细胞内，为细胞的生长、分化和增殖所必需，并在许多病理过程中发挥重要作用【3】。目前，小分子多胺作为一
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种内源性信号分子，已成为国际研究的热点【3-24】。
生物体内多胺水平受精确调控。鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase, ODC）和精脒/精胺乙酰转移酶（spermidine/spermine N1-acetyltransferase, SSAT）分别为多胺合成与分解代谢的限速酶。ODC催化鸟氨酸脱羧生成腐胺，腐胺连接到S-腺苷甲硫氨酸上，在S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（S-adenosylmethionine decarboxylase, SAMDC）的催化下脱羧生成精脒，精脒通过精胺合成酶催化产生精胺。ODC可被多种生长因子、原癌基因、肿瘤促进剂和应激刺激等激活【4,5】；SSAT催化多胺的逆转化分解代谢，依次催化精胺转化为精脒，精脒转化为精胺。此分解反应过程中产生两种有毒代谢副产物3-氨基丙醛和过氧化氢（H2O2），因此，SSAT过度激活（多胺分解代谢增强）引起组织细胞损伤【6】。
（3）多胺的生物学作用
多胺具有广泛的生物学功能，包括抗炎、抗氧化、抗凋亡、调控线粒体通透转运（MPT）、调控离子通道、促细胞增殖及在细胞内信号转导中发挥重要作用等【7-15】。文献报道，连续3天给小鼠腹腔注射精胺(10 mg/kg) 能明显抑制内毒素诱导的血清中炎症介质的释放【7】；多胺可抑制幅射等所引起的DNA损伤和脂质过氧化。活性氧可导致DNA断裂和/或硷基修饰，发生程序性细胞死亡，天然多胺含有类似叠氮钠(单线态氧淬灭剂)的氨基而发挥保护作用【8】；多胺可通过与细胞内带负电荷的生物大分子如核酸及蛋白质等结合稳定染色质、核酶、核酸和/或细胞膜。在分离的肝脏线粒体，精胺通过清除羟自由基，维持谷胱苷肽和巯基的还原状态，抑制线粒体通透转运孔（mPTP()开放【9】。在小鼠WEH1231B细胞和人的T细胞，多胺合成抑制剂引起线粒体膜电位（△ψm）下降和caspase-3激活，外源性多胺可逆转之【10】；细胞内精胺负责内向整流钾通道（irK1）的固有门控和整流特性，精胺通过调控谷氨酸盐受体的某些亚型，影响神经系统神经元和神经胶质细胞的兴奋性和Ca2＋的内流【11】；多胺可直接激活TPK和MAPK，促进原癌基因c-myc, c-jun和c-fos的表达【12】。RTK，PI3K和PKC抑制剂均能抑制生长因子诱导的ODC的磷酸化【13】。多胺为生长过程所必需，但过度产生也常伴有致癌和致组织细胞损伤作用【14,15】。
随年龄增加哺乳类动物组织器官多胺水平降低（肝、肾、骨骼肌、心脏、肺等）,多胺合成限速酶ODC也呈相同下降趋势【16】。在老龄的组织细胞，激素诱导ODC激活的能力也明显降低【17】；健康人血清及尿液中多胺水平也随年龄增加而降低【18】。目前已知，多种食物中富含多胺包括蔬菜、水果、鱼、肉、蛋、奶以及发酵食物如奶酪等，摄食富含多胺的食物对老年人的健康有益【19】。动物实验也证明，小鼠长期摄食富含多胺的食物，能明显降低老化相关的疾病，如肾小球硬化、动脉硬化，降低死亡率【20,21】。最新研究显示（2009, 2010年文献），多胺可通过诱导细胞自噬延长生物体的寿命，具有抗衰老作用【22-24】。Morselli的研究显示，精脒能够诱导培养的酵母、线
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虫、果蝇、小鼠细胞及人的肿瘤细胞自噬，敲除或沉默重要的自噬相关基因（如atg-7，bec-1）取消了精脒延长寿命的作用；小鼠的饮水中加入多胺，也能显著减少衰老引起的氧化应激和细胞坏死【23】。Eisenberg证明精脒延长寿命的机制是通过抑制组蛋白乙酰转移酶使组蛋白去乙酰化，进而转录激活自噬相关基因atg7, atg11和atg15,诱导细胞自噬【24】。
（4）衰老心肌自噬能力下降及其影响的下游事件
自噬是存在于真核细胞中的生命现象，通过自噬清出细胞内受损的蛋白质和细胞器，维持细胞内稳态，对生物体正常发育及防治老化有积极的作用。分子水平上的研究发现，调节自噬和调节衰老的信号通路之间存在相互联系【25】。研究显示，随着年龄增加心肌细胞自噬能力明显降低，导致变性的蛋白质和损伤的细胞器不能有效被清除,细胞稳态发生变化【26】。衰老心肌线粒体自噬减少导致线粒体功能异常，表现为线粒体数目减少，体积增大，呼吸链上的各种酶复合体活性下降，呼吸链电子传递功能障碍，能量代谢障碍。线粒体功能异常导致呼吸链电子漏出ROS产生增加、线粒体DNA发生突变、蛋白质交联、巯基氧化、DNA甲基化下降、组蛋白乙酰化失控和生物膜脂质过氧化，造成大量的变性蛋白质和受损细胞器堆积在细胞内【27】。线粒体损伤使线粒体膜电位降低，线粒体发生通透性转运，cytc及凋亡诱导因子（AIF）释放入胞浆，引起细胞凋亡。近年来研究发现，自噬可通过清除受损的线粒体延迟和对抗凋亡【28】。在营养缺乏的情况下，少量线粒体通透转运孔（mPTP）开放，启动细胞自噬清除受损的线粒体，对细胞有保护作用。损伤严重时，大量的线粒体mPTP开放，cytc和AIP等释放入胞浆，激活凋亡程序。Xue等学者应用自噬抑制剂或基因沉默等手段证明自噬的发生早于凋亡【29】。Yan在猪慢性心肌缺血的实验中证实，自噬能够抑制慢性缺血引起的细胞凋亡，减轻缺血性心肌损伤【30】。Tracy的研究也显示线粒体损伤和mPTP开放是低氧诱导自噬的关键因子，能够促进营养缺乏状态下自噬体的形成,有利于细胞存活【31】。因此提示：衰老的心肌细胞→自噬能力下降→老化和受损的线粒体堆积→氧自由基产生增加→mPTP开放数目增加→细胞凋亡。这可能是老龄心肌丧失缺血预适应保护作用的重要机制。小分子多胺在这一级联反应中发挥怎样的作用? 还不清楚？
(5)国内外研究现状及我们的工作基础
从文献检索看，关于多胺的研究，国内外差距较大。表现在国内发表的论文数量少,主要涉及肿瘤诊断及癫痫、胃炎等多胺含量测定【32-34】，个别涉及细胞凋亡相关基因克隆、多胺代谢等【35】。多胺与心血管系统的关系少见报道（仅见于我们自己发表的文章，见作者代表作）。国外的大部分研究主要集中在多胺与肿瘤和脑损伤的关系，小部分涉及肠、肝、肺、肾等器官[36]。多胺在心肌的作用主要集中在多胺与心肌肥大的关系涉及心肌缺血的较少。Woodcock 等报道到，大鼠心肌缺血/再灌注引起IP3释放伴再灌注性心律失常发生，庆大霉素和精胺(5mM)有效抑制之【37】。Ventura
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等的研究发现，精胺可诱导电刺激大鼠心脏发生负性肌力作用伴[Ca2+]i短暂降低，无刺激则不改变静息状态下的[Ca2+]i【38】。我们自己最的系列研究显示，多胺在成年大鼠心肌IR损伤及IPC保护中发挥重要作用【39,40】。但关于多胺在老龄缺血心肌的作用，国内外均未见报道。因此，多胺在老龄心血管系统中的生理作用和病理意义有待研究。
前期我们在国家自然科学基金课题的资助下（NO.30770878，2007-2010，本人为课题主持人）在离体灌流成年大鼠心脏上首次发现，IPC处理能够上调成年大鼠心肌的多胺合成代谢（多胺合成限速酶ODC表达增加，总多胺池增加），给予ODC特异性抑制剂α-difluoromethylornithine(DFMO) 取消了IPC介导的心肌保护作用，证明多胺是介导IPC心肌保护作用的内源性信号分子（见后面工作基础）；进一步证明IPC诱导的ODC/多胺通路上调主要与PKC、Erk1/2、PI3K/Akt信号转导通路的激活有关【39】。文章发表在Mol Cell Biochem. 2009 (332) 135–144上。之前我们的另一项国家自然科学基金资助课题 (NO.30470688，2005—2007, 本课题申请人为第二完成人）的研究发现,缺血/再灌注(IR)损伤心肌多胺代谢失衡，腐胺增加，精脒、精胺减少总多胺池耗竭。外源性精胺 (1mmol/L)能补充细胞内的多胺池，并通过下调死亡受体通路、抑制线粒体凋亡通路、清除自由基、抑制细胞内钙超载发挥心肌保护作用【40】。文章发表在European Journal of Pharmacology 2007,（562）236–246.上（见后面工作基础）。
（6）本课题关注的问题
基于我们前期的研究发现及文献报道心肌组织中的多胺随年龄增加而减少，多胺具有诱导细胞自噬、抗炎、抗氧化清除自由基、抗凋亡、调节线粒体钙缓冲以及多胺在细胞内信号转导中发挥重要作用等独特的生物学功能。我们提出：“外源性多胺可能恢复老龄心肌对IPC刺激的敏感性”。预实验结果初步证实了我们的推测。我们在离体心脏灌流模型上观察到，老龄大鼠心脏在离体灌流前慢性给予外源性多胺（多胺灌胃6周，参照文献给药量【20】），多胺恢复了老龄心肌对IPC刺激的敏感性（心脏功能有明显改善，冠脉流出液中LDH水平有明显降低），多胺合成限速酶ODC特异性抑制剂DFMO取消了这种改变（实验数据见后面的研究工作基础）。但关于老龄IR与IPC心肌多胺代谢的特点和规律如何？外源性多胺能否恢复老龄心肌对IPC刺激的敏感性？如果能，其机制是什么？以及多胺在老龄IPC心肌保护中作用的准确效应靶点是什么？这些还不清楚，这些是本课题研究的主要内容。
本课题将在原有工作基础上，在器官、细胞及分子水平上观察青年与老年IR与IPC心肌多胺代谢变化的规律和特点，探讨老龄心肌IR损伤及IPC保护和多胺水平变化的内在联系。观察外源性多胺对老龄IPC心肌细胞自噬、线粒体功能、氧化应激及细胞凋亡的影响。通过诱导或阻断自噬（siRNA干扰）和调控线粒体通透转运（开放或抑制mPTP）干预，探讨外源性多胺是否通过诱导自噬/减少
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线粒体损伤/抑制氧化应激/抗凋亡级联重现老龄心肌IPC保护作用。并进一步细胞、亚细胞水平上探讨多胺发挥作用的准确效应靶点。以上问题的解决将能够验证我们提出的“多胺是介导缺血预适应心肌保护的内源性信号分子、多胺代谢通路可能成为老年心肌缺血/再灌注损伤防治的新靶点”的假说。目前，国内外未见相关报道。本课题的完成，为老龄心肌缺血/再灌注损伤的防治提供一种新思路、新靶点和新的技术平台。具有重要的理论意义和应用价值。
参考文献：
1. Boengler K, Schulz R, Heusch G. Loss of cardioprotection with ageing. Cardiovasc Res. 2009;83(2):247-261.
2. Jahangir A, Sagar S, Terzic A. Aging and cardioprotection. Appl Physiol. 2007;103(6):2120-2128.
3. Wang YL, Jr. Casero R. Mammalian polyamine catabolism: Atherapeutic target, a pathological problem, or both? J. Biochem. 2006;(139):17-15.
4. Voskas D, Mader R, Lee J. Tumour promoter mediated altered expression and regulation of ornithine decarboxylase and S-adenosylmethionine decarboxylase in H-ras-transformed fibrosarcoma cell lines. Biochem Cell Biol. 2001; 79:69-81
5. Turchanowa L, Rogozkin VA, Milovic V, Feldkoren BI, Caspary WF, Stein J Influence of physical exercise on polyamine synthesis in the rat skeletal muscle. Eur J Clin Invest. 2000;30:1-3.
6. Zahedi K, Lentsch AB, Okaya T, et al. Spermidine/spermine-N1-acetyltransferase ablation protects against liver and kidney ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2009; (4):G899-909.
7. Zhu S, Ashok M, Li J, Li W, Yang H, Wang P, Tracey KJ, Sama AE, Wang H. Spermine protects mice against lethal sepsis partly by attenuating surrogate inflammatory markers. Mol Med. 2009;(7-8):275-282.
8. Das KC, Misra HP, Hydroxyl radical scavenging and singlet oxygen quenching properties of polyamines, Molec Cell Biochem. 2004;(262):127-133．
……
2．项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题（此部分为重点阐述内容）；
2.1研究内容
（1）在器官水平上观察青年与老年大鼠IR、IPC心肌多胺代谢变化的特点与规律。应用离体灌流大鼠心脏，复制青年与老年大鼠心肌缺血/再灌注（IR）与缺血预适应（IPC）模型，观察心肌多胺代谢情况（多胺合成与分解限速酶与多胺池的变化）。观察指标：
多胺代谢分析：①高效液相色谱法测定心肌组织中多胺，包括腐胺、精脒、精胺的含量；②14C-标
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记，液闪计数法分析多胺合成限速酶鸟氨酸脱羧酶（ODC）与分解代谢限速酶精脒/精胺乙酰转移酶（SSAT）活性；③免疫印迹法分析多胺合成与分解代谢限速酶ODC和SSAT蛋白表达。
（2）在器官水平上观察外源性多胺能否通过恢复细胞内多胺池重现老龄心肌IPC保护作用。老龄大鼠多胺灌胃给药6周，取心脏复制离体灌流心脏IPC模型，与未给药的老龄IPC心脏比较，观察外源性多胺对老龄大鼠心肌多胺池的影响，同时观察外源性多胺对老龄大鼠心肌IPC刺激敏感性降低或丧失的恢复能力（心脏功能与心肌损伤评价）。再给予多胺处理的IPC心脏多胺合成限速酶ODC的特异性抑制剂DFMO观察其对IPC心肌保护的干预作用。观察指标: 多胺代谢分析：（同上）。心功能评价:多导生理记录仪记录心功能变化（LVDP、LVEDP、±dp/dt、心率、冠脉流量等）。心肌损伤评价：①TTC染色法测定心肌死面积观察；②比色法检测冠脉流出液中乳酸脱氢酶（LDH）含量变化；③透射电镜观察心肌细胞超微结构观察
（3）在器官上观察外源性多胺对老龄IPC心肌细胞自噬、线粒体功能、氧化应激及细胞凋亡的影响，给予多胺抑制剂、自噬抑制剂以及mPTP开放剂干预，探讨外源性多胺的作用机制。老龄大鼠多胺灌胃给药6周后，取心脏复制离体灌流心脏IPC模型，与未给药的老龄IPC心脏比较,观察心肌细胞自噬、线粒体功能、细胞氧化应激及细胞凋亡情况。再分别给予多胺处理的IPC心脏多胺合成限速酶ODC的特异性抑制剂（α-difluoromethylornithine，DFMO）、细胞自噬抑制剂(3-methyladenine，3-MA）及mPTP开放剂 (atractyloside, Atr) 干预，观察药物干预是否取消了外源性多胺在IPC心脏的作用。观察指标：细胞自噬分析：①透射电子显微镜观察双层膜的自噬体；②Real-time PCR 方法检测自噬相关基因atg-5,Beclin-1表达；③免疫印迹法检测自噬体膜标志性蛋白质LC3，Beclin-1表达。线粒体功能评价：①线粒体呼吸酶复合体Ⅰ，Ⅱ, Ⅲ，Ⅳ的活性变化；②线粒体呼吸控制率变化（RCR）；③高效液相色谱分析心肌ATP, ADP, AMP水平，观察心肌能量代谢情况。细胞氧化应激水平分析:① 细胞脂质过氧化水平，丙二醛（MDA）；② 抗氧化酶的变化：超氧化物歧化酶（MnSOD）,谷胱甘肽过氧化物酶（CAT）活性测定；③ 线粒体氧化损伤的评价：测定线粒体DNA(mtDNA)氧化产物（8-OHdG）生成量和mtDNA编码的呼吸酶复合I成分ND6的表达（免疫印迹法）。细胞凋亡观察：①细胞凋亡检测(TUNEL法)；②促凋亡蛋白Cyt c, Bax, Caspase-9和抗凋亡蛋白Bcl-2，Bcl-xL表达水平（免疫印迹方法检测）。
（4）在衰老的心肌细胞模拟IPC模型上观察外源性多胺对心肌细胞自噬、线粒体功能、细胞氧化应激及细胞凋亡的影响。给予多胺抑制剂、自噬抑制剂及mPTP开放剂干预，观察外源性多胺对IPC心肌的影响。在细胞水平上观察外源性多胺能否恢复老龄心肌细胞IPC保护作用并探讨其机制。应用D-半乳糖诱导分离培养的乳鼠心肌细胞衰老。应用模拟缺血/缺氧液复制IR与IPC心肌细胞模型。给予外源性多胺处理的IPC心肌细胞后，再予多胺合成抑制剂（DFMO）、细胞自噬抑制剂（3-MA）及mPTP
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开放剂（Atr）干预，观察外源性多胺对衰老的IPC心肌细胞自噬、线粒体功能、氧化损伤以及细胞凋亡影响。观察指标：心肌细胞自噬分析：①透射电子显微镜观察双层膜的自噬体；②荧光显微镜下观察自噬体膜标志蛋白（LC3-GFP）转染细胞后，LC3荧光变化；③ 荧光显微镜下观察丹(磺)酰戊二胺(MDC)荧光染色情况；④免疫印迹方法检测自噬相关蛋白Beclin1, LC3 的表达。线粒体功能评价:（同上）。心肌细胞氧化损伤：①MTT方法检测细胞存活率；③H2-DCFDA标记心肌细胞，流式细胞仪检测ROS生成率；④DHE荧光探针标记细胞，荧光显微镜检测ROS的生成情况。细胞凋亡观察：①Hoechst33342染色检测细胞凋亡。②促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白表达水平（同上）。
（5）在细胞水平上观察外源性多胺对衰老心肌细胞自噬、线粒体损伤及细胞凋亡的影响。在此基础上调控自噬或调控mPTP开放，探讨外源性多胺发挥作用依赖的信号级联。应用D-半乳糖诱导分离培养的乳鼠心肌细胞衰老。在给予外源性多胺处理衰老的细胞之后，再分别给予①多胺合成抑制剂(DFMO)，②自噬诱导剂 (rapamycin,Rap)，③自噬抑制剂(3-MA)，④自噬相关基因atg-5 siRNA，⑤线粒体通透转运孔开放抑制剂(Cyclosporin A,Cys A)。 ⑦线粒体通透转运孔开放诱导剂(atractyloside,Atr) ⑥观察其对心肌细胞自噬、线粒体功能以及细胞凋亡情况。观察指标：心肌细胞自噬检测、心肌线粒体功能评价、细胞氧化应激评价、心肌细胞凋亡的评价。同上（4）。
（6）在分离的老龄大鼠心肌细胞及线粒体上，观察外源性多胺对线粒体膜电位、线粒体通透转运孔（mPTP）开放的影响，以及多胺抑制剂和自噬抑制剂的干预作用，探讨多胺发挥作用的效应靶点。应用离体心脏灌流技术分离老龄大鼠心肌细胞，应用差速离心方法分离老龄心肌细胞线粒体用于实验。观察外源性多胺对老龄大鼠心肌细胞线粒体膜电位（△ψm）及线粒体通透转运孔（mPTP）开放的影响，给予多胺合成限速酶ODC的特异性抑制剂（DFMO）或自噬抑制剂(3-MA),观察抑制剂的干预作用。观察指标：
细胞氧化损伤：DHE荧光探针标记心肌细胞，荧光显微镜下观察ROS产生。线粒体膜电位（△ψm）变化：JC-1染色，激光扫描共聚焦显微镜观察。线粒体通透转运孔（mPTP）开放观察：①应用钙电极检测钙诱导的mPTP开放。②Calcein-AM标记线粒体，共聚焦显微镜观察mPTP开放。
2.2 研究目标
(1)本研究通过观察青年与老龄大鼠IR 与IPC心肌多胺代谢的特点与变化规律以及衰老心肌的功能、代谢改变，拟阐明外源性多胺可通过恢复心肌细胞内多胺池重现老龄心脏IPC保护作用。
(2)给予多胺合成抑制剂、自噬抑制剂及mPTP开放剂干预，观察外源性多胺对老龄IPC心肌细胞自噬、线粒体损伤及细胞凋亡的影响。在器官、细胞及分子水平上阐明外源性恢复老龄心肌IPC保护作用的机制。再通过调控自噬和调控mPTP开放干预，进一步证明多胺发挥作用依赖的信号级联。
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(3)在分离的心肌细胞与线粒体水平上观察外源性多胺对老龄IPC心肌线粒体通透转运孔（mPTP）开放的影响，拟证明mPTP是多胺在老龄IPC心肌作用的效应靶点。
2.3 拟解决的关键科学问题：
理论关键：
（1）老龄心肌对IPC刺激的敏感性减弱或丧失是否与老龄IPC心肌ODC/多胺通路激活钝化，多胺分解代谢增强，导致总多胺池减少有关?
（2）外源性多胺能否通过恢复心肌细胞内的多胺池重现老龄心脏IPC心肌保护作用?
（3）最新报道，多胺能诱导多种细胞自噬。本研究中多胺能否诱导衰老的心肌细胞自噬？如果能，其调控的下游事件及作用的末端效应靶点是什么？这是否是其恢复老龄心肌IPC保护作用的机制？
以上问题的阐明，将能够验证我们提出的“多胺是介导老龄大鼠IPC心肌保护作用的信号分子，外源性多胺通过诱导细胞自噬进而启动下游事件恢复老龄心肌IPC保护作用”的观点。
技术关键：
（1）准确测定心肌组织内的多胺（腐胺、精脒、精胺）。
（2）多胺合成与分解代谢限速酶ODC和SSAT活性测定及蛋白质表达分析。
（3）细胞自噬的检测，包括形态学观察，自噬相关基因与蛋白的检测以及能否成功沉默自噬相关基因 (atg-5 siRNA)。
（4）心肌能量代谢、线粒体呼吸控制率变化以及线粒体mPTP开放的检测。
3．拟采取的研究方案及可行性分析（包括研究方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）；
3.1研究方法和技术路线
（1）在器官水平上观察青年与老年大鼠IR、IPC心肌多胺代谢变化的特点与规律
应用离体灌流大鼠心脏，复制青年（3月龄）和老年（18月龄）大鼠心肌缺血/再灌注(IR)与缺血预适应（IPC）模型，观察青年与老龄大鼠IR与IPC心肌的多胺代谢变化规律。
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具体步骤：
① Langendorff离体灌流大鼠心脏心肌IR与缺血预适应IPC模型的建立及分组模型建立:
月龄分别为3个月（青年, 体重在200-250g）与18个月（老年,体重在450-500g）雄性Wistar 大鼠，麻醉同时腹腔注射肝素。开胸取心脏置于冷灌流液中，主动脉逆行插管连接在Langendorff离体灌流装置上，以80mmH2O的压力KH缓冲液灌流心脏，用95% O2和5% CO2 混合气体平衡灌流液。
实验分组（青年与老年大鼠均分为C, IR, IPC组）：（n=8）
对照组（control, C）：大鼠心脏用KH液平衡灌注180min.
缺血/再灌注组（ischemia/reperfusion, IR）：大鼠心脏先预灌平衡20min，然后在无氧、无灌流液的条件下，保持心脏温度恒定在37oC停止灌流40min（缺血），之后再复灌120min（再灌）。
缺血预适应组（ischemic pre-conditioning, IPC）：预灌注平衡20min后再经历短暂的5min缺血，10min再灌注，重复三次，为缺血预处理。之后心脏再经历40min的缺血，120min的再灌注。
② 心肌多胺代谢的变化
心肌多胺含量的测定:采用苯甲酰氯柱前衍生法，反向-高效液相色谱测定心肌细胞内的多胺（RP-HPLC，Waters, 美国）。本方法是我们实验室通过对国外测定生物样品中多胺的方法加以改良，在国内率先建立的,文章发表在《中国病生杂志》2005；21（2）本人为第一作者。
心肌组织多胺合成代谢限速酶ODC及分解限速酶SSAT活性测定:用14C标记，液体闪烁计数仪（LS-6500， Bechman，美国）检测心肌细胞内ODC与SSAT的活性。本方法也是我们实验室对国外的测定方法加以优化后建立的。文章发表在《中国药理学通报》2005；21（5），本人为第一作者。
心肌组织ODC与SSAT蛋白质的表达（免疫印迹法）:取左心室组织，加入预冷的含PMSF（lmmol/L，pH7.4）的蛋白裂解液在液氮内研磨制成匀浆，12000rpm离心30min，提取胞浆总蛋白。取上清，BCA法进行蛋白质定量。蛋白质免疫印迹法检测心肌ODC与SSAT蛋白质的表达。具体方法：取50μg 总蛋白样品于10 %变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转印至PVDF膜，用5%脱脂牛奶封闭后，用抗ODC 或
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SSAT抗体4 ℃孵育过夜。加碱性磷酸酶偶联的二抗，室温孵育40min，显色。β-actin作为一抗对照。光密度扫描半定量分析显影条带，目的条带和β-actin信号面积之比评定其蛋白水平。
（2）在器官水平上观察外源性多胺能否通过恢复细胞内多胺池重现老龄心肌IPC保护作用
老龄大鼠多胺灌胃给药6周后复制离体灌流心脏IPC模型，与未给药的老龄IPC心脏比较，观察外源性多胺对老龄心肌对IPC刺激敏感性降低或丧失的恢复能力以及对多胺池的恢复情况。再给予多胺处理的IPC心脏多胺合成抑制剂(DFMO)，观察DFMO是否取消了外源性多胺对老龄IPC心脏的干预作用。
具体步骤：
……
3.2 可行性分析
理论上可行：
目前已知，老龄心脏对IPC刺激的敏感性减弱或丧失，其机制尚未完全阐明。文献报道，衰老的心肌细胞自噬能力降低，这可能是老龄心肌丧失缺血预适应保护作用的重要机制。细胞自噬减少导致变性和损伤的蛋白质不能被清除，造成细胞损伤。相反，诱导自噬，促进细胞生存。研究显示，随着增龄哺乳类动物多种组织器官多胺含量下降，如心脏、肝脏、骨骼肌等，多胺合成限速酶ODC激活钝化。人和动物实验的研究均证明摄食富含多胺的食物明显降低老化相关的疾病。
我们前期的研究首次证实，①缺血/再灌注损伤心肌总多胺池减少，外源性1mmol/L精胺能补充心肌细胞内的多胺池，并通过清除自由基、降低细胞内钙、抑制细胞凋亡发挥抗心肌缺血/再灌注损伤作用；② 缺血预适应处理上调ODC/多胺通路，细胞内多胺合成增加，多胺是介导成年大鼠IPC心
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肌保护作用的内源性中介分子，其作用与PKC，Erk1/2及PI3K/Akt信号转导通路的激活有关。大量文献也报导了多胺具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、调节线粒体钙缓冲能力等多种生物学功能，尤其最新研究发现，多胺可通过诱导酵母、线虫、果蝇及肿瘤细胞自噬延长其寿命，具有抗衰老作用。
基于以上发现，我们提出：“外源性多胺可能通过诱导自噬恢复老龄大鼠心脏对缺血预适应刺激的敏感性”的观点。预实验初步证实了我们的推测（见后面的工作基础部分）。从以上的研究背景和我们预实验的研究发现来看，本课题设计在理论上是可行的。
技术上可行：
（1）应用反向-高效液相色谱(RP-HPLC)准确测定心肌组织中多胺的方法和14C标记准确测定多胺合成与分解代谢限速酶ODC和SSAT活性的方法为本课题负责人建立，能够保证准确测定心肌多胺的代谢情况。
（2）应用离体灌流大鼠心脏复制心肌缺血/再灌注与缺血预适应模型是本实验室采用的经典模型；诱导衰老的心肌细胞模型也已成功建立（见后面的工作基础部分）。
（3）细胞自噬检测方法、蛋白质免疫印迹检测蛋白质的表达、线粒体呼吸酶复合体活性测定、线粒体呼吸控制率与线粒体mPTP开放检测等实验技术，课题组成员均已掌握，确保完成测定。
（4）细胞转染技术本课题组成员已掌握，能够确保完成课题设计的实验。
4．本项目的特色与创新之处；
细胞信号分子多胺具有广泛的生物学功能，最新研究发现具有诱导自噬，抗衰老作用。我们前期研究首次发现，IR损伤心肌多胺代谢下调，外源性精胺具有心肌保护作用；进一步研究证明多胺是介导成年大鼠IPC心肌保护作用的内源性中介分子。这为本课题对老年IR与IPC心肌多胺代谢特点与规律的研究奠定了良好的基础。
临床上，心肌缺血/再灌注损伤的发生主要见于老年人。
本课题首次以老龄心肌多胺代谢为切入点，在器官、细胞及分子水平上系统、全面地阐述了老龄IR与IPC心肌多胺的代谢特点及规律，重点阐述老龄心肌对IPC刺激敏感性减弱或丧失与多胺代谢变化的内在联系，以及外源性多胺通过恢复老龄心肌细胞多胺池重现IPC保护作用的机制，通过调控细胞自噬和调控线粒体通透转换孔(mPTP)开放干预，拟证明多胺通过诱导衰老的心肌细胞自噬进而启动自噬下游信号级联，通过保护线粒体/抑制氧化应激/抗凋亡通路恢复老龄心肌对IPC刺激的敏感性。进一步应用分离的老龄心肌细胞及线粒体证明mPTP可能是多胺作用的效应靶点。目前，国内外未见相关报道，具有一定的创新性。
课题完成将为老年IPC心肌保护机制的研究提供重要的理论依据，同时也为老年心肌缺血疾病的防治提供更多的治疗选择，基础理论研究的成果更具有临床实用性。
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5．年度研究计划及预期研究结果（包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等）。
5.1年度研究计划
2012. 01—2012. 08 高效液相色谱测定心肌多胺含量；C14标记液闪计数检测多胺合成/分解限速酶限速酶ODC/SSAT活性；免疫印迹测定ODC/SSAT蛋白表达；Powerlab多导生物信号采集系统测定心肌功能；TTC染色测定心肌梗死面积，比色法测定LDH的活性。完成老龄IPC心肌ODC/多胺通路激活钝化及外源性多胺恢复老龄心肌对IPC刺激敏感性的实验。
2012. 09—2013. 08 透射电镜观察双层膜的自噬体；Real-time PCR检测心肌组织自噬相关基因表达；免疫印迹方法检测自噬体膜标志蛋白表达、心肌促与抗凋亡蛋白、mtDNA编码呼吸酶复合体I组分ND6与核DNA编码的蛋白H19的表达；TUNEL方法检测细胞凋亡；细胞核与线粒体DNA 8-OhdG测定；检测MDA等测定。完成外源性多胺恢复老龄心肌对IPC刺激的敏感性与诱导自噬/抑制氧化应激/抗凋亡通路有关的实验。
2013. 09—2014. 05 建立诱导衰老的心肌细胞模型。透射电镜观察心肌细胞双层膜的自噬体；构建pLC3-GFP质粒并转染细胞，荧光显微镜观察细胞自噬标志蛋白分布；MDC荧光染色，激光扫描共聚焦显微镜检测细胞自噬；DHE标记细胞，流式细胞仪检测ROS的生成；流式细胞仪检测细胞凋亡。分离老龄大鼠心肌细胞、分离心肌细胞线粒体对线粒体功能评价，共聚焦显微镜检测线粒体膜电位及通透转运等。完成细胞与亚细胞水平的实验。
2014. 06—2015. 12 课题总结，论文撰写，课题鉴定，成果申报。
5.2 预期研究成果
（1）证明老龄大鼠IPC心肌ODC/多胺通路激活钝化，多胺分解代谢增强，总多胺池减少。
（2）证明外源性多胺可通过恢复老龄心肌细胞内多胺池重现老龄心肌IPC保护作用，多胺是介导老龄心肌IPC保护的信号分子。
（3）证明外源性多胺通过诱导衰老的心肌细胞自噬，进而激活自噬下游信号级联即诱导自噬/保护线粒体/抑制氧化应激/抗凋亡途径恢复老龄大鼠心肌对IPC刺激的敏感性。
（4）证明多胺在老龄心肌IPC保护中作用的效应靶点可能是mPTP。
（5）预期可发表SCI论文2-3篇，培养硕士生2-3名。
（二）研究基础与工作条件
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1．工作基础（与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩）；
2．工作条件（包括已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径，包括利用国家实验室、国家重点实验室和部门重点实验室等研究基地的计划与落实情况）；
3．承担科研项目情况（申请人和项目组主要参与者正在承担的科研项目情况，包括国家自然科学基金的项目，要注明项目的名称和编号、经费来源、起止年月、与本项目的关系及负责的内容等）；
4．完成国家自然科学基金项目情况（对申请人负责的前一个已结题科学基金项目（项目名称及批准号）完成情况、后续研究进展及与本申请项目的关系加以详细说明。另附该已结题项目研究工作总结摘要（限500字）和相关成果的详细目录）。
（三）申请人和项目组主要参与者简介（在读研究生除外）。
按以下格式填写：
姓名
所在单位及职称
格式：机构名，院系，职称
例如：北京大学，医学院生物化学系，教授
受教育经历（从大学本科开始，按时间倒排序）
格式：开始年月-结束年月，机构名，院系，学历
例如：1991/09 – 1995/06，北京大学，医学院生物化学系，博士
研究工作经历（按时间倒排序）
格式：开始年月-结束年月，大学，院系，职称
例如：1991/09 – 1995/06，北京大学，医学院生物化学系，教授
主要论著（近3年来已发表的与本项目有关的主要论著目录和获得学术奖励情况，按以下格式填写）
1．期刊论文： 所有作者（通讯作者以“*”标出），论文标题，期刊名
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称，卷(期), pp起始页码，发表年份
例：郑丹、中国癌症地图解析, 决策与信息， 第2卷，第3期, 120-125页，2010
2．会议论文：所有作者（通讯作者以“*”标出），论文标题，会议名称，会议时间，pp起始页码，会议地址，发表年份，说明
例：郑丹, 中国癌症地图析, 决策与信息国际会议论文集, 120-125页，北京，2010.04.12-15，大会报告
3．专著：所有作者，专著名称（章节标题），出版社, 总字数，出版年份
例：郑丹， 中国癌症地图解析, 科技出版社. 128万字，2010
4．奖励：所有获奖人，获奖项目名称，奖励机构，奖励类别，奖励等级，颁奖年份
例：郑丹，中国癌症地图，国家科技部， 国家科技进步奖，二等奖，2010
5．专利：发明人，专利名称，授权时间，授权国别，专利号
例：郑丹. 中国癌症地图，2010.9，中国，ddddddddddddd
（四）经费申请说明 购置单项经费5万元以上固定资产及设备等，须逐项说明与项目研究的直接相关性及必要性。
（五）其他需要说明的问题
无。
（六）附件清单
随纸质申请书一同报送的附件。如：不具有高级专业技术职务、同时也不具有博士学位的申请人应提供的推荐信；在职研究生申请项目的导师同意函等。
无。
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签字和盖章页(此页自动生成,打印后签字盖章) 解除保护
申 请 人：王二 依托单位：广州中医药大学
项目名称：外源性多胺恢复老龄大鼠心肌缺血预适应保护作用的机制研究
资助类别：面上项目 亚类说明：
附注说明：
申请人承诺：
我保证申请书内容的真实性。如果获得资助，我将履行项目负责人职责，严格遵守国家自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，认真开展工作，按时报送有关材料。若填报失实和违反规定，本人将承担全部责任。
签字：
项目组主要成员承诺：
我保证有关申报内容的真实性。如果获得资助，我将严格遵守国家自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，加强合作、信息资源共享，认真开展工作，及时向项目负责人报送有关材料。若个人信息失实、执行项目中违反规定，本人将承担相关责任。
编号
