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医学论文
低温、维拉帕米对大鼠睾丸扭转复位后的保护作用
添加时间: 2019-11-1 12:05:23 来源: 作者: 点击数:809

中文摘要

目的通过采用不同的方法对大鼠一侧睾丸扭转模型进行处理,探讨维拉帕米、低温对大鼠睾丸扭转复位后缺血-再灌注损伤、生殖细胞的凋亡及睾丸生精功能的影响。并通过该试验和对以往文献的分析探讨睾丸扭转复位后生精细胞的损害机制以及不同影响因素对睾丸扭转复位后保护效果的比较,为其临床治疗和预防提供理论依据。

:对60只健康青春期SD大鼠编号,采用数字随机法随机分成五组(ABCDE组),每组12只,A组为睾丸扭转组,B组为睾丸扭转加维拉帕米组,C组为睾丸扭转加低温组,D组为睾丸扭转加维拉帕米、低温组,E组为对照组,建立单侧(左侧)睾丸扭转模型,并依据设计对各组施加处理因素,术后3天各组处死6只大鼠,取手术侧睾丸平均分为3部分,第一部分入液氮保存,检测catsodgshpx活性和MDA含量,第二部分入4%多聚甲醛溶液保存,常规做石蜡切片行HE染色,光境下观察组织学变化,第三部分快速入4°C生理盐水中行流式细胞术检测凋亡细胞百分比。术后60天处死剩余动物,取手术侧睾丸,常规石蜡包埋,行HE染色,行睾丸组织的平均makler评分(testicular mak1er scoreTMS)。数据采用卡方检验比较,任两组间比较采用LSD检验。

结果:形态学观察:3天后处死动物手术侧睾丸颜色、质地依A组、BC组、D组、E组顺序为由暗红,质软到正常;HE染色:除E组光境下观察正常外,其余各组生精细胞排列不整齐,层次减少,上皮部分变性,生精细胞数量减少,可见凋亡小体及坏死区,并且部分区域可见炎症细胞浸润,其中扭转组最明显,B组与C组次之,D组最轻;catsodgshpx活性,A组较E组减低,B组、C组、D组较A组升高,B组与C组间差异无统计学意义,B组、C组较D组减低;MDA含量,A组较E组升高,B组、C组、D组较A组减低,B组与C组间差异无统计学意义,B组、C组较D组升高;生殖细胞凋亡率,A组较E组升高,B组、C组、D组较A组减低,B组与C组间差异无统计学意义,B组、C组较D组升高;TMSA组较E组减低,B组、C组、D组较A组升高,B组与C组间差异无统计学意义,B组、C组较D组减低。

结论:睾丸扭转复位后抗氧化能力下降、活性氧生成增多和大量钙离子内流使睾丸细胞凋亡增加可导致睾丸生精能力下降;维拉帕米能阻止钙离子进入细胞内,减轻钙超载,提高睾丸组织抗氧自由基的能力;低温能抑制氧自由基的产生及其引发的脂质过氧化反应;二者均可使生殖细胞凋亡降低,保护扭转复位睾丸的生精功能;维拉帕米和低温联合应用能更好的提高扭转复位睾丸的抗氧化能力,减轻活性氧的释放,减少钙离子内流从而减少生殖细胞的凋亡,保护睾丸的生精功能。

关键词:睾丸扭转;缺血-再灌注损伤;细胞凋亡;流式细胞术


The protective effects of verapamil and hypothermia on the testis following torsion/detorsion in rats

Postgraduate           Wang Yujun

Speciality              Surgery

Supervisor             Pro. Gao Dianjun

abstract

objective: this thesis aims to investigate a) the protective effects of verapamil and hypothermia on torsion/detorsion testis , the influence of apoptosis germ cells and the protective effects on sperm-producing by different treatment on left torsion testis of rat models; b)the demange mechanism of germ cells after testicular torsion and comparison between effects of different  methods in order to offer theoretical bases for clinical treatment and prevention.

Methods: 60 healthy male Sprague-Dawley rats were divided into five equal groups(ABCD and E). All rats were normally fed. Group ABC and D were submitted to unilateral 720°testicular torsion. Every group was differently treated according to different set methods and detorsion were done after 2 hours.72 hours later, 6 rats of every group were killed and the left testis was took out and divided into three parts. The first one was kept by liquid nitrogen temporarily and then its biochemical indicator was examined with refer to the superoxide desmutase (SOD);the activity of catalase(CAT);the activity of glutathione peroxidase(GSHPX) and the level of malonic diethylaldehyde(MDA); the second one was used to make hematoxylin and eosin(HE) stained slice, the histological changes were observed by light microscope; the third one was put into Sodium Chloride whose temper is 4℃ immediately and then to detect the proportion of apoptosis cells by flow cytometry. One month later, the other rats of each group were killed and their left testises were took out to make hematoxylin and eosin(HE) stained slices in order to make testicular mak1er score(TMS).

Results: morphological observation indicate that the color and quality of operated testis was from dark red and soft to normal trait according to the sequence from group ABCD and E. the observation of HE stained slices indicated that except group E, the germ cells were untidily arranging; the part of epidermis degenerated, germ cells reduced, apoptosis body and necrosis can be see, some fields can find infiltration of inflammatory cells, which are most obvious in group A and most slight in group D. SODCATGSHPX activity and MDA level had significant difference between group A and B, A and c, a and d, a and e, there was no statistical significance between group b and c, however, there was  statistical significance difference between group b and d, c and d; The proportion of apoptosis cells had had significant difference between group A and B, A and c, a and d, a and e, there was no statistical significance between group b and c, however, there was  statistical significance difference between group b and d, c and d; The tms had had significant difference between group A and B, A and c, a and d, a and e, there was no statistical significance between group b and c, however, there was  statistical significance difference between group b and d, c and d.

Conclusion: The descent of Oxidation resistance, the increase of active Oxygen generation and the Ca2+ inflow are very important reasons which cause the testis hurt after torsion/detorsion, they can increase the apoptosis of germ cells and then to reduce the sperm-producing. Verapamil can resist the Ca2+ inflow, increase the resistance of Oxidation, hypothermia can repress the generation of Oxygen-derived free radicals and peroxidatic reaction of lipid. Both of them can decrease the apoptosis of germ cells and protect the germ-producing of the operated testis. The results are better when they are combined together.

Key words: testicular torsion; cell apoptosis; ischemia/reperfusion injury; flow cytometry


符号说明

英文缩写

英文全名               

中文全名

ADP     

adenosine dephosphate    

二磷酸腺苷

AIF     

apoptosis inducing factor  

凋亡诱导因子

AMP

adenosine monophoshate  

一磷酸腺苷

ATP

adenosine triphoshate      

三磷酸腺苷

Bcl-2   

B-celllymphoma/leukemia-2  

B细胞淋巴瘤/白血病-2

CAT

catelase                 

过氧化氢酶

GSPHX

glutathione peroxidase      

谷胱甘肽过氧化物

HE

hematoxylin-eosin          

苏木素-伊红

IL

interleukin            

白介素

I-R

ischemia-reperfusion injury  

缺血再灌注损伤

MDA

maleic dialdehyde          

丙二醛

PCD

programmed cell death    

程序性细胞死亡

PBS

phosphate balanced solution

盐酸缓冲液

PI       

Propidium Iodide            

碘化丙啶

RH123   

Rhodamine 123         

罗丹明123

SOD

superoxide dismutase         

超氧化物歧化酶

TT

testicular torsion             

睾丸扭转

XD

xanthine dehydrogenase     

黄嘌呤脱氢酶

XO

xanthine oxidase           

黄嘌呤氧化酶


前言

睾丸扭转是泌尿外科急症之一,是指精索沿其纵轴旋转,精索内血液循环产生障碍,导致睾丸缺血、甚至坏死。此病由Delasiauve1840年首次报告。既往发病率不高,近30年来发病率明显上升[1]Barada等人[2]报告25岁以下的男性发病率高达1/4000。因此本病并非少见,应引起临床医师高度重视。该病多见于青春前期及青春期,若治疗不及时常导致睾丸功能损伤和低生育症。随着对该病的重视和新的诊断技术(Dopplor超声,核素扫描)的应用,早期诊断和手术复位患者增加,复位睾丸的存活率大大提高。

研究大量临床资料发现,术后仍有相当一部分患者出现患侧睾丸萎缩和无功能、生精能力低下、精子活动力差,甚至对侧睾丸功能亦受到影响,从而导致男子不育 [5-7]

研究表明,睾丸扭转复位后引起睾丸的缺血再灌注(ischemia /reperfusionI/R)过程,该过程进而引起睾丸生殖细胞凋亡增加,其发生与氧自由基的损伤密切相关,组织缺血、缺氧后,体内氧自由基的生成和清除系统动态平衡被打破。抗氧化酶如SOD, GSH-PX等被大量消耗,而氧自由基储积增多,引起脂质过氧化反应,影响精子生理功能并诱导生殖细胞凋亡;其发生还与缺血再灌注后引起的Ca2+内流密切相关,组织缺血时,由于缺氧、底物供应缺乏及利用障碍,致ATP生成减少,影响跨膜离子转运。ATP缺乏导致Na+. Ca2+入胞,K+出胞,同时由于Na+-K+-ATP酶失活,因而Ca2+在胞浆内及线粒体内储留。细胞内钙离子既是损伤因子,又可能充当第二信使细胞内游离钙超载时[8],激活钙离子依赖性核酸内切酶,从而使双链DNA在核小体Linker部位裂解,形成DNA裂片。另一方面,钙超载时可活化蛋白酶C,令其转移至细胞膜,使G蛋白磷酶化,G蛋白减少,胞内cAMP增加,导致细胞凋亡。此外,细胞内Ca2+增加可通过增Ca2+依赖性蛋白酶活性,加速黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶,从而促进氧自由基的生成。许多方法(包括物理和化学方法)被应用于治疗睾丸I/R损伤,如低温、睾丸激素、别嘌呤醇、维生素EsoDm40403非肽类的sod)、咖啡酸苯乙酯(cape,一种抗氧化和抗感染药)、高压氧、中药葛根素、刺五加、川穹嗪银杏叶提取物等,这些疗法均有一定的疗效。

为了给本病的临床提供充足必要的理论依据,更好地保护睾丸扭转病人的生育能力,很多学者对其进行了大量深入的研究。鉴于目前对睾丸缺血再灌注损伤的研究均为单一因素的保护性治疗作用,多种因素混合作用下的保护作用的研究相对较少,而且对单因素作用及多因素作用保护效果有无差异还缺少这方面的探讨,因此我们建立睾丸扭转复位动物模型,进行不同的处理,测定各组mda含量、sodcatGSHPX活性、睾丸细胞凋亡百分比及睾丸的生精功能(TMS),探讨维拉帕米、低温在大鼠睾丸扭转复位后睾丸I/R损伤中的保护作用,以及各组间作用的差异。探讨多种保护因素的共同作用对减少睾丸损伤的作用效果,探讨能减轻再灌注损伤的最佳方法,既提高睾丸手术复位后的生存力,又能提高复位睾丸的生理功能,为临床治疗提供理论依据。


材料与方法

1试验材料

1.1试验动物的选择

选择60只健康雄性sd大鼠,鼠龄78周,体重200240克,正对应青春期阶段。大鼠购于中国人民解放军第89医院实验动物中心,层流架饲养,每个笼中饲养5只,给予标准大鼠饲料和无菌水喂养,饲料购于潍坊医学院实验动物中心。

1.2药品与试剂

戊巴比妥钠                              上海生化制药厂进口分装

维拉帕米注射液                          上海禾丰制药有限公司

                                        (批号:国药准字H31021343

超氧化物歧化酶(sod)测定试剂盒         南京建成生物工程有限公司

丙二醛(mda)测定试剂盒                 南京建成生物工程有限公司

过氧化氢酶(cat)测定试剂盒             南京建成生物工程有限公司

谷胱苷肽过氧化物酶(gshpx)测定试剂盒   南京建成生物工程有限公司

考马斯亮兰蛋白测定试剂盒                南京建成生物工程有限公司

罗丹明123Rh123)                      美国singma公司

碘化丙啶(pi                          美国singma公司

1.3主要仪器设备

QpⅢ型生物切片机                          上海生物机械厂

Bh2型普通光学显微镜                       日本olympus公司

Swcjif超静工作台                        苏净集团安泰公司

facalalibur流式细胞仪                       美国bd公司

yds10液氮生物容器                         四川亚西机器厂

721可见光分光光度计                         上海棱光技术有限公司

海尔bcd21电冰箱                          青岛海尔集团

Leicadme光学显微镜                          德国Leica公司

Gilson微量可调移液器                        法国Gilson公司

H300型水浴恒温振荡器                      太仓市科教器材厂

PRIM台式高速低温离心机                      德国氏仪器公司

FA2004电子天平                              中国上海天平厂

Eppendorf移液器                              德国

YXQG41780-A型高压消毒锅                    中国上海医用核子仪器厂

YDS-10液氮生物容器                          四川亚西仪器厂

BH-2型生物光学显微镜及照相系统              日本OLYMPUS公司

1.4特殊液体的配制方法

1. 0.01m pbs液的配制

氯化钠                                          9g

磷酸氢二钠(12h2o                            6g

磷酸二氢钠(2h2o                             0.4g

DW加至                                       1000ml

氢氧化钠调ph                                7.27.6

2实验设计

本实验以sd大鼠为研究对象,将试验动物分为五组,建立单侧睾丸扭转模型,对维拉帕米、低温因素对睾丸扭转复位后生殖细胞的凋亡及生精功能的作用进行探讨,并且对二者合用的作用与各个因素单独应用进行比较,探讨二者合用比单独应用效果的差别;另外还设立对照组,分析扭转因素的作用,采用方差分析及LSD检验A组较E组、B组和C组及D组较A组、B组较C组、B组和C组较D组差别有无统计学意义。

3试验方法

3.1动物分组与处理方法

60只健康雄性sd大鼠随机分成五组:a组为扭转组;b组为扭转加维拉帕米组;c组为扭转加低温组;d组为扭转加维拉帕米、低温组;e组为对照组。每组12只,常规饲养。

3.2动物模型的建立

睾丸扭转的模型制作,按Turner法进行操作。

麻醉:用2%戊巴比妥钠(50mg/kg)行腹腔注射麻醉。仰卧固定于操作台上。

消毒:备皮后碘伏消毒下腹部及阴囊,铺无菌巾单。

手术操作:左侧阴囊低位旁正中切口,切开阴囊、肉膜、游离出睾丸、附睾,结扎切断睾丸引带。沿睾丸长轴顺时针扭转睾丸720°,无菌丝线固定睾丸上极于阴囊肉膜以防睾丸自发复位,然后进行如下操作:

A组:行左侧睾丸扭转保持2小时后扭转睾丸复位并固定在阴囊内,关闭切口。

B组:行左侧睾丸扭转保持2小时后扭转睾丸复位并固定在阴囊内,关闭切口,并于复位前30分钟通过阴茎背静脉缓慢注入1mg/kg维拉帕米注射液。

C组:行左侧睾丸扭转保持0.5小时,将其置入无菌生理盐水冰屑烧杯(50ml)内保持1.5小时,用温度计控制其表面温度,使其保持在913°c之间。关闭部分切口,湿纱布覆盖外露的睾丸及周围组织,2小时后将扭转睾丸复位并固定于阴囊内,关闭切口。

D组:行左侧睾丸扭转保持0.5小时,将其置入无菌生理盐水冰屑烧杯(50ml)内保持1.5小时,用温度计控制其表面温度,使其保持在913°C之间。关闭部分切口,湿纱布覆盖外露的睾丸及周围组织,2小时后将扭转睾丸复位并固定于阴囊内,关闭切口,并于复位前30分钟通过阴茎背静脉缓慢注入1mg/kg维拉帕米注射液。

E组:将左侧睾丸扭转后立即复位固定,关闭切口。

3.3取材

快速断颈法处死大鼠,立即取出左侧睾丸,将新鲜睾丸平均分成三部分,一部分放入液氮罐内保存,以后行生化指标检测,第二部分放入4%多聚甲醛中固定,第三部分置入4°c生理盐水中,随即进行流式细胞术检测程序。

3.4石蜡切片的制作:

标本室温下4%多聚甲醛中固定8小时,常规冲洗、梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、制备成石蜡块,连续切片,厚为5μm,裱片于干净载玻片上。60°c烤片30分钟,37°c过夜后冰箱保存备用。

3.5 he染色

1从冰箱中取出备染切片,复温,蒸馏水洗涤1分钟。

2苏木精染色4分钟,自来水充分冲洗。

370%盐酸乙醇分化10秒,1%氨水返蓝20秒,自来水冲洗15分钟。

4伊红染色1分钟,自来水充分冲洗。

570%酒精3分钟,80%酒精3分钟,95%酒精10分钟。

6无水乙醇10分钟,无水乙醇Ⅱ10分钟。

7二甲苯10分钟,二甲苯Ⅱ10分钟。

8中性树胶封片。

3.6光学显微镜观察

    对各组大鼠睾丸组织切片均进行观察,主要观察曲细精管的完整性,生精上皮(精母细胞、初级精母细胞、次级精母细胞),间质细胞和支持细胞的形态排列、坏死水肿等情况。

3.7睾丸组织的平均makler评分(testicular mak1er scoreTMS)评分标准见表3235

取出左侧睾丸,固定染色制成切片。每例标本镜下随机观察10个曲细精管断面,分别测定曲细精管内径D,管周膜厚度M,管壁生殖细胞层数P,生殖细胞成熟程度S,每个项目按05分评分,4个项目的满分为20分,然后从评分结果计算其平均得分TMS(testicular mak1er score),

4 流式细胞术测定凋亡细胞百分比测定

1取出新鲜睾丸组织入4°c生理盐水充分洗净。

2眼科剪将组织充分剪碎。

3200目铜网过滤剪碎组织,取滤液。

4pbs液,1200rpm离心5min,弃上清。

5pbs液,1200rpm离心5min,弃上清。

6pbs2ml

7调整细胞数约为0.8×106/ml

820μl细胞悬液,加20μl罗丹明12350μg/ml),37°C水, 浴30分钟。

9pi50μg/ml8μl,室温下避光10分钟。

10pbs2ml,重悬细胞,1200rpm离心5min,弃上清。

11pbs2ml,重悬细胞,1200rpm离心5min,弃上清。

12溶血,加一倍氯化铵1ml,溶血5分钟。

131200rpm离心5min,弃上清。

14pbs2ml,重悬细胞,1200rpm离心5min,弃上清。

15pbs400μl,重悬细胞,入流式细胞仪检测,记录每样本中凋亡细胞占细胞总数百分比及记录双变量散点图。

5 生化指标的检测(sodcatgshpx活性和mda含量及组织蛋白吸光度)

5.1制备睾丸组织匀浆

1液氮中取睾丸组织(0.21.0g)在冰冻生理盐水中漂洗,除去血液,滤纸拭干,称重,放入5ml的小烧杯中

2计算0.86%的冷生理盐水用量,体积总量是组织块重量的9倍,先用移液管取总量的2/3于小烧杯中,用眼科剪尽快剪碎组织块。

3手工匀浆:将剪碎的组织倒入玻璃匀浆器中,再将剩余1/3量的冷生理盐水冲洗残留在烧杯中的组织块,一起倒入匀浆器中进行匀浆,左手持匀浆管下端插入盛有冰水混合物的容器中,右手将捣杆插入套管中,上下转动研磨数十次(10分钟左右),充分研碎,使组织匀浆化。

4离心,将制备好的10%的组织匀浆用普通离心机3000rpm离心15分钟,将离心好的匀浆留上清,弃沉淀,备用。

5.2吸光度的测定

取适量上清液,根据试剂盒所述的比色法,分别测定sodcatgshpx活性和mda含量。

(一) 睾丸组织匀浆总sod的吸光度测定

 试剂盒的组成与配制:

试剂一:贮备液:5ml×1瓶(天冷时或放冰箱会有部分结晶析出,需热水浴溶解后再用);试剂一应用液的配制:用时加热蒸馏水稀释至50ml4°c保存。

试剂二:液体5ml×1瓶,4℃~10℃保存。

试剂三:液体5ml×1瓶,4℃~10℃保存。

试剂四:液体350μl×1支,4℃保存,不可冷冻;4号稀释液5ml×1瓶,4°c保存。用时二者按114稀释,可以一次稀释,也可以分次稀释,配好的试剂四4°c保存,不可冷冻。配好后可保存23个月。注:所用吸嘴最好为专用且消毒处理过。

试剂五:粉剂×1支,用时加7080℃蒸馏水37.5ml溶解后备用,若加热过程水分蒸发减少,此时必须用蒸馏水补充至37.5ml,配好后试剂避光4°C冷藏。

试剂六:粉剂×1支,用时加蒸馏水37.5ml溶解后备用,配好后试剂避光4°c冷藏保存。

显色剂的配制:按试剂五:试剂六:冰乙酸=332的体积比配成显色剂,4°c避光冷藏

 操作方法:

试剂

测定管

对照管

试剂一(ml

1.0

1.0

样品  (ml

0.05

 

蒸馏水(ml

 

0.05

试剂二(ml

0.1

0.1

试剂三(ml

0.1

0.1

试剂四(ml

0.1

0.1

用漩涡混匀器充分混匀,置37°C恒温中水浴40分钟

显色剂

2

2

混匀,室温放置10分钟,于波长550nm处,1cm光径比色杯,蒸馏水调零,比色。

每个样品均按上述步骤进行检测,分别记录结果。

 组织匀浆中总sod活力(u/mgprot*)的计算:

a 定义:每毫克组织蛋白在1ml反应液中sod抑制率大50%时所对应的sod为一个sod活力单位(u

b 计算公式:

组织匀浆中sod活力=(对照管吸光度-测定管吸光度)÷对照管吸光度÷50×(反应液总体积/取样量(ml))÷组织中蛋白含量

c 注明:sod活力u/mgprot)组织中蛋白含量(mgprot/ml

*  mgprot为毫克蛋白数。

(二)睾丸组织匀浆cat的吸光度检测

①试剂盒的组成与配制:

试剂一:液体100ml×1瓶,4°c保存。

    试剂二:底物液体100ml×1瓶,4°c保存。

    试剂三:显色粉剂一瓶,临用前加蒸馏水至100ml溶解,4°c保存。

    试剂四:液体10ml×1瓶,保存。天冷时会凝固,临用前须热水溶至试剂透明方可使用。

②操作步骤:

1%组织匀浆制备:准确称取组织重量,加99倍生理盐水制成1%组织匀浆,3000rpm离心10分钟,取上清待测。按下列方法进行操作。

 

对照管

测定管

试剂一(37°C预温)(ml

1.0

1.0

试剂二(37°C预温)(ml

0.1

0.1

蒸馏水(ml

0.05

 

1%组织匀浆(ml

 

0.05

混匀,37°C准确反应1分钟

试剂三(ml

1.0

1.0

试剂四(ml

0.1

0.1

   混匀,0.5cm光径,405nm处,蒸馏水调零,测定各管吸光度。

   每个样本组织匀浆均按上述步骤进行检测,分别记录结果。

 组织匀浆中过氧化氢酶活性的计算:

a 定义:每毫克组织蛋白每秒钟分解1μmolH2O2的量为一个活力单位。

b 公式:

组织匀浆中cat活力=(对照管od值-测定管od值)×271*×(1.0ml/60秒×取样量(ml))÷1%匀浆蛋白含量

c 注明:*271为斜率的倒数

        组织匀浆中cat活力(u/mgprot

        匀浆蛋白含量(mgprot/ml

(三)睾丸组织匀浆GSHPX的吸光度检测

1.试剂盒的组成与配制:

a100管试剂盒的组成:

试剂一:贮备液,一瓶,2ml4ºC保存6个月;

试剂二:甲粉,一瓶;乙粉,一瓶;

试剂三:粉剂,一瓶;

试剂四:粉剂,一瓶,避光4ºC保存;

试剂五:粉剂,四支,避光4ºC保存;

试剂六:GSH标准品粉剂,3.07mg6支;

试剂七:GSH标准品溶剂贮备液,一瓶,20ml4ºC保存。

b、试剂的配制和保存:

试剂一:用时取0.1ml加蒸馏水至10ml,也就等于100稀释配成应用液,4ºC保存;

试剂二:甲粉:加90100ºC的蒸馏水170ml,充分完全溶解;乙粉:加90100ºC的蒸馏水50ml,充分完全溶解;试剂二应用液的配置:将已配好的甲乙两种溶液混合,此为饱和溶液,室温静置冷却后如有结晶,则取上清进行实验,4ºC或室温保存;

试剂三:加蒸馏水200ml溶解,4ºC保存;

试剂四:加蒸馏水50ml溶解,避光4ºC保存;

试剂五:每支加蒸馏水10ml溶解,避光冷藏保存五天;

试剂七:标准品溶剂应用液:贮备液∶双蒸水=19,即10倍稀释配成应用液;按所需用量现用现配,4ºC保存。

cGSH应用液的配制:

1mmol/LGSH溶液:GSH的分子量为307每次测定前将13.07mgGSH标准品粉剂加到GSH标准品的溶剂应用液中,定容至10ml即为1mmol/LGSH溶液,现用现配。

100μmmol/LGSH溶液:取1mmol/LGSH溶液2mlGSH标准品溶剂应用液18ml定容至20ml,做标准曲线用,若不做标准曲线可以不配。

20μmmol/LGSH标准溶液:取1mmol/LGSH溶液0.2mlGSH标准品溶剂应用液.定容至10ml,即为20μmmol/LGSH标准溶液。

2.操作方法

1)样本的前处理:

110%组织匀浆的置备:

a、取组织块(0.21克)用冰冷的生理盐水漂洗,除去血液,滤纸拭干,称重,放入510ml的小烧杯中。

b、用量筒量取预冷的0.86%生理盐水,量取的量为组织重量的9倍。用移液管将总量的2/3生理盐水移入烧杯。用眼科剪尽快剪碎组织块(太热时小烧杯要放入冰水中)。

c、将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中,再将剩下的三分之一0.86%生理盐水用来冲洗残余在小烧杯中的碎组织一起倒入玻璃匀浆管中进行匀浆,左手持匀浆管将下端插入盛有冰水的器皿中,右手将杆垂直插入套管中上下转动研磨数十次(68分钟);充分磨碎,使组织匀浆化。

2)、组织中GSH-PX活力测定操作表:

1)、酶促反应:

 

非酶管*(对照管)

酶管(测试管)

1mmol/LGSH(ml)

0.2

0.2

样本**ml

 

0.2

37ºC水浴准确反应5分钟

试剂二(ml

2

2

  本(ml

0.2

 

混匀,35004000/分,离心10分钟,取上清1ml作显色反应。

 

空白管

标准管

非酶管(对照管)

酶管(测定管)

GSH标准品的溶剂应用液(ml)

1

 

 

 

20μmmol/LGSH标准溶液(ml)

 

1

 

 

上清液(ml)

 

 

1

1

试剂三(ml)

1

1

1

1

试剂四(ml)

0.25

0.25

0.25

0.25

试剂五(ml)

0.25

0.25

0.25

0.25

混匀,室温静置15分钟后,412nm处,1cm比色杯,蒸馏水调零,测定各管OD值。

1*空白管、标准管、非酶管(对照管)、一般只需做12只,对于特别精细的实验每个样本均需做对照管。

2 最佳取样量及最佳取样浓度因样品种类不同,其GSH-PX活力不一。根据酶的百分抑制率与酶的活力呈抛物线关系,各种测定样品取样量及取样浓度不一样,在测定一种新的样品前最好选择一个最佳取样量及最佳取样浓度。

3.组织中GSH-PX活力的计算:

1)、定义:规定每毫克蛋白质,每分钟扣除非酶反应的作用,使反应体系中GSH浓度降低1μmmol/L为一个酶活力单位。

【注】组织蛋白的测定:参照本研究所提供的试验方法学中的双缩脲法、考马斯亮兰法、紫外法及磺基水杨酸法测出所取样品中的蛋白毫克数。

2)、公式:

组织GSH-PX活力=(酶管OD值-酶管OD值)÷(标准管OD值-空白管OD值)×标准管浓度(20μmmol/LGSH×稀释倍数(5*÷反应时间÷待测浓度样本蛋白含量

【注】:从酶促反映表中可看出反应液0.5ml加试剂二2ml,在反应液中为5倍稀释,所以乘以5

(四) 睾丸组织匀浆mda的吸光度检测

1. 试剂盒的组成与配制:

   试剂一:液体10ml×1瓶,室温保存。(天冷时会凝固,每次测试前适当水浴箱加温以加速溶解,之至透明方可使用。)

   试剂二:液体6ml×1瓶,用时加170ml双蒸水混匀(注意不要碰到皮肤上)。

   试剂三:粉剂×1支,用时将粉剂加入到90100°c的双蒸水30ml中,(在溶解过程中可适当加热),充分溶解后用双蒸水补足至30ml再加冰醋酸30ml,混匀,配好的试剂避光保存。

   标准品:10nmol/ml四乙氧基丙烷5ml×1瓶。

2. 操作方法

1操作表

 

标准管

标准空白管

测定管

测定空白管

10nmol/ml标准品

0.2

 

 

 

无水乙醇(ml

 

0.2

 

 

测试样品(ml

 

 

0.2

0.2

试剂一(ml

0.2

0.2

0.2

0.2

混匀(摇动几下试管架)

试剂二(ml

3

3

3

3

试剂三(ml

1

1

1

 

50%冰醋酸(ml

 

 

 

1

漩涡混匀器混匀,试管口用保鲜膜扎紧,用针头刺一小孔,95℃水浴(或用锅开盖煮沸)40分钟,取出后流水冷却,然后35004000rpm离心10分钟。取上清(吸取上清比色时最好用移液器吸取上清加入比色皿中,尽量避免倾倒,以免沉淀进入比色皿,影响吸光度)。532nm处,1cm光径,蒸馏水调零,测各管吸光度。

每个样本均按上述步骤进行检测,分别记录结果。

2参考取样量,组织匀浆取10%匀浆0.10.2ml较好,本试验取0.2ml

3标准管参考吸光度:当标准管取样量为0.1ml时,则标准管吸光度减去标准空白管的吸光度为0.0650.170。当标准样品取样量为0.2ml时,则标准管吸光度减去标准空白管吸光度为0.1300.140

4若发现检测样本吸光度太低,则可将水浴时间40分钟延长至80分钟,但同一课题中mda的检测都必须延长至80分钟,以免造成批间差异。

3. 组织中mda含量的计数公式:

组织mda含量计算公式=(测定管吸光度-测定空白管吸光度)/( 标准管吸光度-标准空白管吸光度) ×标准品浓度÷蛋白含量

注明: 组织中mda含量(nmol/mgprot):纳摩尔/毫克蛋白

       标准品浓度(10nmol/ml

       蛋白含量(mgprot/ml

(五)睾丸组织蛋白吸光度检测

1. 试剂与配制

①考马斯亮兰贮备液:30ml×1瓶。临用时按所需量用双蒸水14稀释(即五倍稀释),配成应用液,4°C 保存。

②蛋白标准1瓶:61.5g/L。用时以生理盐水稀释成1.3 g/L以下的浓度;4°C 保存。

2. 样本前处理:

准确称取待测组织的重量,按重量体积比加生理盐水制备成10%的组织匀浆,10003000rpm离心10分钟。然后取组织匀浆上清再用生理盐水按19稀释成1%组织匀浆,待测。

4. 操作表:

 

标准管

空白管

测定管

蒸馏水(ml

 

0.05

 

1g/L左右的标准液(ml

0.05

 

 

样品(ml

 

 

0.05

考马斯亮兰显色剂(ml

3.0

3.0

3.0

漩涡混匀器混匀,静置10分钟,于595nm处,1cm光径,空白管调零,测定各管吸光度。

所用样本均按上述步骤测定,分别记录结果。

蛋白含量计算公式:蛋白含量=测定管吸光度/标准管吸光度× 标准管浓度

注明:蛋白含量(g/L

标准管浓度(g/L

6 统计方法

本试验统计分析采用方差分析,计量资料均用 ± s表示,各组间两两比较用LSD检验。统计软件采用SPSS11.5进行分析。


结果

1大体标本改变

各大鼠阴囊内取出睾丸时,观察其外形都为椭圆饱满状,镊子夹取时有弹性。各组手术侧睾丸颜色变化为:A组充血明显,色泽暗红;BC组颜色变化基本相同,介于A组、D组之间;D组基本接近正常质地,颜色稍暗;E组正常结构。

2显微镜下改变(HE染色)

睾丸组织切片光镜下观察: E组生精细胞排列整齐,层次清楚,结构正常,有明显的管腔,细胞数量多,精原细胞、初级精母细胞分裂活跃,管腔内充满大量精子细胞和精子,精子生成多,细胞形态未见异常;其余各组除生精细胞排列不整齐,层次减少,上皮部分变性,生精细胞数量减少,减少的细胞主要为精原细胞和初级精母细胞,可见凋亡小体及坏死区,并且部分区域可见炎症细胞浸润(以中性粒细胞为主),A组最明显,D组最轻。HE染色结果见图1-5

3流式细胞术各组手术侧睾丸细胞凋亡百分比结果

3.1各组大鼠手术侧睾丸细胞凋亡百分比方差分析及各组两两比较LSD检验结果:

1.扭转组与维拉帕米组间手术侧睾丸细胞凋亡百分比差异有统计学意义(P<0.01

2.扭转组与低温组间手术侧睾丸细胞凋亡百分比差异有统计学意义(P<0.01

3.扭转组与维拉帕米+低温组间睾丸细胞凋亡百分比差异有统计学意义(P<0.01

4.扭转组与对照组间手术侧睾丸细胞凋亡百分比差异有统计学意义(P<0.01

5.维拉帕米与低温组间手术侧睾丸细胞凋亡百分比差异无统计学意义(P>0.05

6.维拉帕米组、低温组与维拉帕米+低温组间手术侧睾丸细胞凋亡百分比两两比较差异均有统计学意义(P<0.01

数据见表62431,双变量散点图见图711

4生化指标测定结果(catsodgshpx活性和MDA含量)

4.1各组手术侧睾丸catsodgshpx活性和MDA含量方差分析及组两两比较LSD检验结果:

1.扭转组与维拉帕米组间catsodgshpx活性减低,MDA含量升高,差异有统计学意义(P<0.01

2.扭转组与低温组间catsodgshpx活性减低,MDA含量升高,差异有统计学意义(P<0.05

3.扭转组与维拉帕米+低温组间catsodgshpx活性减低,MDA含量升高,差异有统计学意义(P<0.01

4.扭转组与对照组间catsodgshpx活性减低,MDA含量升高,差异有统计学意义(P<0.01

5.低温组与维拉帕米组间catsodgshpx活性和MDA含量差异无统计学意义(P>0.05

6.维拉帕米组、低温组与维拉帕米+低温组间catsodgshpx活性减低,MDA含量升高,差异有统计学意义(P<0.01

    数据见表122021222326272830

5睾丸生精功能(TMS)结果

5.1各组大鼠手术侧睾丸TMS方差分析及各组两两比较LSD检验结果:

1.扭转组与维拉帕米组间手术侧睾丸TMS差异有统计学意义(P<0.01

2.扭转组与低温组间手术侧睾丸TMS差异有统计学意义(P<0.01

3.扭转组与维拉帕米+低温组间睾丸TMS差异有统计学意义(P<0.01

4.扭转组与对照组间手术侧睾丸细胞TMS差异有统计学意义(P<0.01

5.维拉帕米与低温组间手术侧睾丸TMS差异无统计学意义(P>0.05

6.维拉帕米组、低温组与维拉帕米+低温组间手术侧睾丸TMS两两比较差异均有统计学意义(P<0.01

    数据见表162529


  

睾丸扭转由Delasiauve1840年首次报告,既往发病率不高,近30年来发病率明显上升[1]Barada等人[2]报告25岁以下的男性发病率高达1 /4000。临床上,以睾丸鞘膜为界,将睾丸扭转分为鞘膜外型(扭转部位发生在睾丸鞘膜以上的精索,故也称精索扭转)和鞘膜内型(扭转发生在睾丸上极与精索连接部或睾丸与附睾之间的系膜),前者少见,主要发生于新生儿,后者多见,临床上睾丸扭转多属此型,常在青春期发病。

睾丸扭转是泌尿外科的急症之一,常需急症手术处理。睾丸扭转46小时未被复位,生精细胞将发生不可逆的死亡[9,10]临床上对短时间睾丸扭转者行复位固定术,恢复了血供,避免了睾丸发生梗死,然而睾丸的生精功能到底有无变化呢?许多研究表明,一侧睾丸扭转复位后同侧睾丸生精功能严重低下[3-7],还影响对侧睾丸,使睾丸生精功能低下,发生机制可能与睾丸扭转复位后睾丸缺血-再灌注有关。最大程度地保护睾丸,保护睾丸扭转病人的生育能力,已成为泌尿外科医师需要解决的问题之一。

1 动物模型的选择与建立

睾丸扭转/复位是睾丸缺血再灌注的过程,本试验采用青春期SD大鼠构建一侧睾丸扭转/复位动物模型,为使动物模型尽量接近于人类睾丸扭转,该模型的构建时尽可能地模拟临床上睾丸扭转地病理过程,故采用手术扭转一侧睾丸,而不是简单地给予精索结扎;扭转的程度要造成脉管闭塞,我们将睾丸扭转720º,达到脉管完全闭塞,血流完全停止,并使睾丸缺血程度达到一致;手术损伤尽可能减小,低位阴囊旁正中切口减轻了创伤可能的影响;对扭转睾丸予以固定,防止睾丸在外科复位前自然回转,降低扭转程度,影响试验结果的准确性。

2. 缺血与再灌注损伤

2.1缺血和缺氧性损伤

缺血和缺氧损伤是细胞损害最常见的类型,缺血通常为动脉阻塞而导致血流减少或中断所致。缺氧时组织内糖酵解尚能进行,而缺血时糖酵解产生能量的过程也停止。因此缺血比缺氧对组织损伤更为迅速和严重。缺血影响细胞内的氧化磷酸化过程,ATP耗竭,细胞依赖能量的钠泵的活性下降导致细胞内钠的潴留和K+向细胞外的弥散。钠潴留导致细胞内水的增多,形成细胞水肿和内质网扩张。Ca2+泵的活性下降导致Ca2+的内流,细胞内Ca2+的浓度升高,可导致很多细胞内成分的损伤。ATP耗竭使细胞内合成蛋白的细胞器遭到破坏,如粗面内质网的核糖体脱失,蛋白质合成下降,如果缺血持续,细胞出现不可逆的损伤。线粒体严重肿胀、细胞膜广泛破坏、溶酶体肿胀、大量钙内流到细胞内激活细胞内的蛋白酶类,细胞发生坏死。线粒体损伤后导致线粒体内膜高导电性通道的形成,成为线粒体渗透性移位,伴有细胞色素C渗透到细胞质中,细胞色素C是微电子传递链中的重压成分,可在细胞质中启动细胞凋亡。

2.2缺血-再灌注损伤

并不是所有缺血的组织器官在血流恢复后都会发生缺血-再灌注损伤,许多因素可以影响其发生程度: 缺血时间:缺血时间长短与再灌注损伤的发生与否有关。缺血时间过长或过短都不能发生再灌注损伤。另外,不同动物不同器官发生缺血再灌注损伤所需的缺血时间不同,小动物较短,大动物相对较长,睾丸扭转时间的长短与组织损伤的程度成正相关[11],研究表明,I/R损伤与细胞凋亡密切相关[12]Turner等将大鼠睾丸扭转1h后复位,再灌注4h,睾丸组织白细胞迁徙和浸润明显增多、脂质过氧化增高,随着再灌注时间的延长(4-18h)生精细胞凋亡也随之增强加,提示扭转复位后睾丸损伤与生精细胞凋亡增加有关[13] 侧枝循环,缺血后侧枝循环容易形成者,因可缩短缺血时间和减轻缺血程度,不易发生再灌注损伤。  对氧的需求程度,对氧需求高的组织器官,如心、脑等,因氧易接受电子,形成氧自由基增多,容易发生再灌注损伤。  低温、pH值、电解质浓度、再灌注条件等因素对缺血再灌注损伤也有影响。

2.3缺血与再灌注损伤的发生机制

缺血-再灌注损伤的发生机制尚未完全阐明,目前主要认为与氧自由基生成、钙超载和白细胞激活有关[14,15]

2.3.1自由基的作用

自由基(free radical)是外层轨道上有单个不配对电子的原子、原子团和分子的总称。自由基的种类很多,如脂质自由基(lipid radicalL·)、氯自由基(Cl·)和甲基自由基(CH3·等。其中由氧诱发的自由基称为氧自由基(oxygen free radical),可以分为非脂质自由基和脂质自由基。活性氧(reactive oxygen speciesROS)是指一类由氧形成的、化学性质较基态氧活泼的含氧代谢物质,包括氧自由基和非自由基物质,如单线态氧(1o2)H2O2。单线态氧(1o2)是一种激发态氧,易氧化不饱和脂肪酸;H2O2氧化能力很强,易接收一个电子生成OH·。

线粒体在将分子氧化还原成水的过程中产生能量,同时会产生少量自由基,在生理条件下,由于细胞内存在超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidaseGSH-PX)、过氧化氢酶(catalaseCAT)等抗 氧化酶类及时清除自由基,使自由基的生成和降解处于动态平衡,所以对机体并无有害影响。在病理条件下,由于活性氧产生的过多或机体抗氧化能力下降,则可引发氧化应激(oxidative stress)反应,导致细胞损伤甚至细胞死亡。

用电子自旋共振技术直接测定氧自由基,发现再灌注后几秒钟至几分钟内,血液和心肌组织中氧自由基的含量可增加数倍。缺血期组织含氧量减少,作为电子受体的氧含量不足,再灌注时恢复组织氧供应,也提供了大量的电子受体,使氧自由基在短时间内爆发式增多。缺血再灌注损伤时主要通过以下途径激发产生氧自由基:1黄嘌呤氧化酶途径:黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidaseXO)及其前身黄嘌呤脱氢酶(xanthine dehydrogenaseXD)主要存在于毛细血管内皮细胞内,正常情况下,90%XD的形式存在,XO仅占10%,当组织缺血缺氧时,由于ATPadenosine triphosphate)含量很低,钙离子转运功能障碍,Ca2+进入细胞内激活Ca2+依赖性蛋白酶,促使XD大量转变成XO,同时,由于ATP分解,ADPadenosine diphosphat)、AMPadenosine monophoshate)含量升高,并分解为次黄嘌呤,故缺血时组织中次黄嘌呤大量堆积。再灌注时,大量分子氧随血液进入缺血组织,黄嘌呤氧化酶催化次黄嘌呤转变为黄嘌呤并进而催化转变为尿酸释放大量电子,造成活性氧大量增加。2中性粒细胞途径:中性粒细胞在吞噬活动时耗氧量增加,其摄入O270%90%NADPH氧化酶和NADH氧化酶的催化作用下接受电子形成氧自由基,用于杀灭病原微生物。组织缺血可激活补体系统,或经过细胞膜分解产生多种具有趋化活性的物质,如C3片断、白三烯等吸引、激活中性粒细胞。再灌注时组织重新获得O2的供应,激活的中性粒细胞耗氧量显著增加,产生大量的氧自由基,即呼吸爆发或氧爆发,造成细胞损伤。3线粒体:线粒体是细胞氧化磷酸化反应的主要部位,再灌注时,损伤的电子传递链成为氧自由基的重要来源。缺血缺氧时ATP含量减少,钙离子进入线粒体增多,使线粒体功能受损,细胞色素氧化酶系统功能失调,以致进入细胞内的氧经单电子还原而形成的氧自由基增多,而经4价还原生成的水减少。有学者认为钙离子进入线粒体可以使锰-超氧化物酶减少,对自由基的清除能力下降,进而使自由基的含量增加。

实验表明,给予外源性自由基发生剂可使正常缺血组织细胞受到严重损伤,自由基清除剂则可有效减轻再灌注损伤[16-19]。自由基性质极为活泼,一旦生成,即可经其中间代谢产物不断扩展生成新的自由基,形成连锁反应。自由基可与各种细胞成分,如膜磷脂、蛋白质、核酸等发生反应,造成细胞结构损伤和功能代谢障碍:1膜脂质过氧化(lipid peroxidation)增强,膜脂质微环境的稳定是保证膜结构完整和膜蛋白功能正常的基本条件,而细胞膜的损伤是自由基损伤细胞的早期表现。自由基对磷脂膜的损害主要表现在可以与膜内多价不饱和脂肪酸作用,形成脂质自由基和过氧化物,从而破坏膜的正常结构、间接抑制膜蛋白的功能、促进自由基及其它生物活性物质的生成及减少ATP的生成。2抑制蛋白质的功能,自由基可使细胞结构蛋白和酶的巯基氧化,形成二硫键;也可使氨基酸残基氧化,,胞浆及膜蛋白和某些酶交联形成二聚体或更大的聚合物,直接损伤蛋白质的功能。3破坏核酸及染色体,自由基可以使碱基羟化或DNA断裂,从而引起染色体畸变或细胞死亡。氧自由基除直接造成多种物质氧化外,还可以通过改变细胞功能引起组织损伤。例如,O2ˉ·可以灭活一氧化氮,影响血管舒缩反应;OH·可以促进白血病粘附到血管壁,生成趋化因子和白血病激活因子;自由基还可促进组织因子生成和释放,加重DIC

2.3.2钙超载

Ca2+的稳态平衡是维持细胞许多生理功能的基础,正常情况下,细胞内钙主要储存于线粒体和肌浆网,胞浆内游离钙浓度低于0.1μmol/L。在缺血-再灌注损伤、氧反应、钙反常及pH反常时,均可见 胞浆钙浓度明显增加,而且钙浓度升高的程度往往与细胞受损的程度成正相关。缺血的睾丸组织在再灌注过程中由于细胞膜的损伤和离子代谢的异常,导致细胞膜功能障碍,Ca2+平衡遭到破坏,最终形成钙超载。其原因可能是:1缺血缺氧时,细胞氧化磷酸化功能降低,ATP合成减少,离子泵失效,特别是Na+-K+-ATP+ 酶功能减退,使得大量Na内流,K外流,细胞膜电位降低产生去极化,引起电压依赖性钙通道开放,大量Ca2+内流;2由于K+、蛋白激酶C以及递质的释放等作用,可使受体依赖性Ca2+通道开放,导致大量Ca2+内流;3胞浆内Ca2+升高到一定水平时,可激活磷脂酶C,水解磷脂酰肌醇(PIP3)产生甘油二酯(DAG)、三磷酸肌醇(IP3)和前列腺素(PG)等,是细胞内钙库释放Ca2+,即诱发钙的释放,进一步增加细胞内Ca2+水平;4缺血再灌注损伤时可有生物膜损伤,生物膜损伤使其通透性增加,细胞外Ca2+顺浓度差内流增加。Ca2+增加可激活磷脂酶,促进膜磷脂降解,进一步增加膜的通透性;更为重要的是由于再灌注时生成大量的自由基,使细胞膜脂质过氧化,加重膜的破坏;5 自由基损伤和膜磷脂分解可造成肌浆网膜损伤,钙泵功能抑制使肌浆网摄Ca2+减少,胞浆Ca2+浓度升高。线粒体膜损伤抑制氧化磷酸化,使ATP生成减少,细胞膜和肌浆网钙泵能量供应不足,促进钙超载的发生。钙超载引起再灌注损伤的机制可能是:1线粒体功能障碍:再灌注后,胞浆内Ca2+浓度明显增加,刺激线粒体钙泵摄钙,是胞浆内Ca2+向线粒体转移。这在灌注早期有一定代偿意义,可减少胞浆钙超载的浓度。但线粒体过多的摄入Ca2+,除增加ATP消耗外,Ca2+与线粒体内含磷酸根的化合物结合,形成不溶性硫酸钙,干扰线粒体的氧化磷酸化,使ATP合成减少;2激活多种酶:Ca2+浓度升高可激活磷脂酶类,促使膜磷脂分解,使细胞膜及细胞器膜结构受到损伤。此外,膜磷脂降解产物花生四烯酸、溶血磷脂等增多,亦可加重细胞功能紊乱。钙可激活蛋白酶,促进细胞膜和结构蛋白的分解。钙可激活某些ATP酶,加速ATP消耗。钙还可激活核酶,引起染色体损伤。3促进氧自由基的生成:细胞内Ca2+增加可通过增强Ca2+依赖性蛋白酶活性,加速黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶,从而促进氧自由基的生成。

2.3.3白细胞的作用

白细胞激活介导的微血管损伤在缺血再灌注损伤的发病中起重要的作用。中性粒细胞激活及其致炎细胞因子的释放是引起微血管床及血液流变学改变和产生无复流现象的病理生理学基础。再灌注时白细胞的聚集和激活的主要机制是:1再灌注损伤可以使细胞膜磷脂降解,释放出大量的趋化因子,如白三烯、血小板活化因子(paf)以及补体和激肽等,吸引大量中性粒细胞聚集于缺血区的血管内并进入组织。2再灌注期间,激活的中性粒细胞也可以释放具有趋化作用的炎性介质,如白介素(interleukinIL)等,促进更多的白细胞聚集和浸润。3再灌注期间,中性粒细胞和血管内皮细胞表达黏附因子增加,加剧了缺血组织内白细胞聚集和激活。在再灌注早期(数秒至数分钟)血管内皮细胞内原先储存的一些蛋白质前提被活化,释放多种细胞黏附分子(adhesion molecule),促进中性粒细胞黏附和聚集;再灌注数小时后,血管内皮细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间黏附着一大类分子,如整合素、选择素、细胞间黏附分子及血小板内皮细胞黏附分子等。黏附分子在维持细胞结构完整和细胞信号传导中起重要作用。激活的中性粒细胞可释放肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1IL-6,引起血管内皮细胞和白细胞表面黏附分子暴露,两者的亲和力增强。随着再灌注时间的延长,致炎因子和白细胞激活因子如IL-8、血栓素A2和血小板激活因子等释放不断增加,促进中性粒细胞的黏附和激活。而黏附的中性粒细胞与血管内皮细胞进一步激活,自身合成和释放更多的具有趋化作用的炎性介质,形成恶性循环。激活的中性粒细胞介导的再灌注损伤主要体现在两个方面:1微血管损伤,正常情况下,血管内皮细胞与血液中流动的中性粒细胞有相互排斥的作用,这是保证微血管灌流的重要条件。再灌注时,白细胞黏附是微血管血流阻碍的重要原因;再灌注时,损伤的血管内皮细胞肿胀可导致管腔狭窄,阻碍血液灌流。特别是激活的中性粒细胞和血管内皮细胞可释放大量缩血管物质,如内皮素、血管紧张素Ⅱ、血栓素A2等,而扩血管物质如一氧化氮的合成和释放减少,造成微血管舒缩功能改变。缺血细胞肿胀使微血管受压,也可促进无复流现象的发生,加重细胞的损伤和坏死;自由基损伤和中性粒细胞粘附使微血管通透性增高,从而使细胞间质水肿,而中性粒细胞从血管内游走到细胞间隙,直接释放细胞因子造成组织细胞的损伤。2细胞损伤,激活的中性粒细胞与血管内皮细胞可释放大量的致炎物质,如自由基、蛋白酶、细胞因子等,不但可以改变自身的结构和功能,而且使周围组织细胞受到损伤,导致局部炎症反应。

综上所述,目前认为缺血再灌注损伤发生的基本机制尚未彻底阐明。缺血再灌注时生成的自由基可促进钙超载,胞浆内游离钙增加有加速自由基的产生,共同导致再灌注损伤。而中性粒细胞作为再灌注时自由基、细胞黏附分子及其致炎因子的重要来源,在再灌注损伤的发生发展中也起重要作用。此外,细胞代谢紊乱也参与再灌注损伤的发生,例如再灌注时引起的细胞内液迅速碱化,可致活多种酶,加速细胞的分解;线粒体损伤造成的能量生成不足。血管内皮细胞损伤导致的多种生物活性物质释放和血管舒缩功能紊乱,也可加重缺血再灌注损伤。

3 细胞凋亡

3.1细胞凋亡与细胞凋亡的意义

凋亡是美国病理学家Kerr等人于1972年最早提出,它是指由体内外因素触发细胞内予存的死亡程序而导致的细胞死亡过程为细胞凋亡(apoptosis),也称为程序性细胞死亡(programmed cell deathPCD),它是一个主动的、高度有序的、由基因控制及一系列酶参与过程。细胞凋亡有重要的生理和病理意义:1确保正常发育、生长,机体的发育、生长过程并不仅仅与细胞的增殖与分化有关,凋亡在器官、组织的形成、成熟过程中也发挥了重要作用。它可以清除多余的。失去功能价值的细胞;2维持内环境的稳定,受损、突变或衰老的细胞如果存留在体内就可能干扰机体的功能,甚至演变成多种疾病。为了维持内环境的稳定,机体必须及时将这些细胞清除,清除这些细胞的主要方式就是凋亡3发挥积极的防御作用,细胞凋亡参与了机体的防御反应,例如当机体受到病毒感染时,受感染的细胞发生凋亡,使DNA发生降解,整合于其中的病毒也随之被破坏,因而阻止了病毒的复制。

3.2细胞凋亡的大致过程

从细胞受到凋亡诱导因素的作用到细胞凋亡大致可分为四个阶段:1凋亡信号转导:细胞内外的凋亡诱导因素通过各种受体作用于细胞后,细胞产生一系列复杂的生化反应,形成与细胞凋亡有关的第二信使,然后通过细胞内的信号转导途径激活后续凋亡程序。2凋亡基因的激活:调控凋亡的基因接收到由信号转导途径传来的死亡信号后按预定程序启动,并合成为执行凋亡所需的各种酶类及相关物质。3细胞凋亡的执行:已决定死亡的细胞迅速进入死亡执行阶段,凋亡主要由执行者是核酸内切酶(endogenous nuclease Dnase)和含半胱氨酸的天冬氨酸特异蛋白酶(Caspases4死亡细胞的清除:已经凋亡的细胞可被邻近的巨噬细胞或其它细胞所吞噬、分解。

3.3凋亡时细胞的主要变化

细胞凋亡的形态学特征:凋亡一般为正常细胞群体中单个细胞的死亡。光镜下可见单个细胞与周围细胞分离,核染色质浓缩,嗜酸性增强。在电镜下,凋亡细胞首先出现核的致密化,染色质浓缩,沿着核膜排列(染色质边集),然后染色质逐步分裂为碎片。与此同时细胞器也发生萎缩,失去水分。凋亡细胞皱缩,但细胞膜完整。而后细胞膜下陷,包裹核碎片核细胞器,形成多个凋亡小体(apoptotic bodies, )。凋亡小体外被以包膜,其中可见核碎片,也可见仅为胞质成分。单个细胞凋亡后,相邻细胞(巨噬细胞)可吞噬凋亡小体,并在吞噬溶酶体中消化降解。细胞凋亡发生很快,持续约24小时。整个过程没有细胞内容物外漏,因而不伴有局部炎症反应。

细胞凋亡的生化特征:主要为Caspases激活。在正常细胞内,很多Caspases以前酶的形式存在,其激活可裂解很多重要的细胞蛋白,破坏核骨架和细胞骨架。Caspases激活DNA酶造成DNA 的降解,故动物细胞中出现特征性的DNA降解,再在钙镁离子依赖性内切酶的作用下进一步裂解为180200个碱基小片断,在凝胶中可见DNA梯子现象。动物细胞在其包膜外层表达磷脂酰丝氨酸、血栓粘合素(thrombospondin)。这些物质易同巨噬细胞分泌的蛋白结合而有助于早期被巨噬细胞识别和吞噬,而不引起炎症反应。也可通过激活钙蛋白酶(Calpain),谷氨酰转化酶(transglutaminase)蛋白激酶CPKC)等使细胞骨架断裂,细胞浆蛋白交叉联合而使细胞凋亡。

3.4细胞凋亡的调控

3.4.1细胞凋亡的相关因素

细胞凋亡的相关因素包括诱导性因素和抑制性因素两大类。1诱导性因素:细胞凋亡是一个程序化的过程,这个过程虽然已经预设于活的细胞中,正常情况下它并不是“随意”启动的,只有当细胞受到来自细胞内外的凋亡诱导因素作用的时候,它才会启动,使细胞一步步走向死亡,因此凋亡诱导因素是凋亡程序的启动者。在少数情况下细胞凋亡可以自发产生,但多数是在诱导因素下产生,常见的诱导因素有:(1)激素和生长因子失衡:生理水平的激素和生长因子是细胞生长不可缺少的因素,一旦缺乏,细胞会发生凋亡;相反,某些激素和生长因子过多也可导致细胞凋亡。如:强烈的应激引起的淋巴细胞数量减少,主要是由于大量糖皮质激素分泌,诱导淋巴细胞凋亡所致。(2)理化因素:射线、高温、强酸、强碱、乙醇、抗癌药物等,均可导致细胞凋亡。如:电离辐射可产生大量氧自由基,使细胞处于氧化应激状态,DNA受损,引起细胞凋亡。(3)免疫性因素:免疫细胞在生长、分化及执行防御、自稳、监视功能中其免疫分子参与了免疫细胞或靶细胞的凋亡过程。(4)微生物学因素:细菌、病毒等致病微生物及其毒素可诱导细胞凋亡。2抑制性因素:一些细胞因子(IL-2,神经生长样子等)具有抑制凋亡的作用,当其从细胞培养基中去除后,依赖它们的细胞会发生凋亡;相反,在培养体系中加入所需要的细胞因子后,由于促进了细胞内存活基因的表达,细胞凋亡受到抑制;某些激素(ACTH、睾丸酮、雌激素等)对于防止靶细胞凋亡,维持其正常的存活是必需的;此外,某些二价金属阳离子如:Zn2+,药物如:苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制剂,病毒如:EB病毒,牛痘病毒CrmA等中性氨基酸也具有抑制细胞凋亡的作用。

3.4.2凋亡信号的转导

大多数情况下离子细胞外和细胞内的凋亡诱导因子作用于细胞后可转化为细胞凋亡信号,并通过细胞内不同的信号转导途径,最终激活细胞死亡程序,导致细胞凋亡。因此,凋亡信号转导途径是连接凋亡诱导因子和核DNA片断化裂解及细胞结构蛋白降解的中间环节。这个系统特点是:1多样性:不同种类的细胞有不同的信号转导系统。2同一性:不同的凋亡诱导因素可以通过同一信号转导系统触发细胞凋亡3耦联性:即死亡信号的转导系统与细胞增值、分化过程中的信号转导系统在某些环节上有交叉、藕联;因此,同一个信号,在不同条件下即可引起凋亡,也可以引起增殖4多途径性:同一诱导因素可经过多种信号转导途径触发凋亡。

目前对细胞凋亡信号转导的认识尚不够完善、深入。迄今为止,研究较多的信号转导系统有胞内Ca2信号系统;cAMP/PKA信号系统;Fas蛋白、FasL信号系统;神经酰胺信号系统;二酰甘油、蛋白激酶C信号系统;酪氨酸蛋白激酶信号系统。

Ca2+作为公认的细胞第二信使介导了许多重要的细胞翻译,如:肌细胞收缩、免疫细胞活化及细胞增殖等。80年代初研究糖皮质激素诱导胸腺细胞凋亡时发现,细胞凋亡发生时胞内游离Ca2+难度显著上升。用Ca2+载体A23187,认为升高B淋巴细胞内Ca2+水平,可诱导B淋巴细胞的凋亡;而用钙络合剂降低细胞内Ca2+水平,可阻止细胞的凋亡。因此,Ca2+在细胞凋亡中充当了传递信号的角色。胞内Ca2+浓度上升可引起后续反应如:激活Ca2+依赖的谷氨酰胺转移酶,活化核转录因子等触发细胞凋亡。

3.5细胞凋亡的发生机制

现有资料表明,细胞凋亡的发生机制可能与下列因素有关:1氧化损伤:氧自由基化学性质活泼,破坏机体正常的氧化/还原的动态平衡,造成生物大分子的氧化损伤,干扰正常的生命活动,形成严重的氧化应激状态,机体氧化损伤的后果之一就是诱导细胞凋亡。2钙稳态失衡:各种凋亡刺激因素,如TNF-α,CD3抗体等引起的细胞凋亡是钙依赖过程。凋亡发生时胞浆Ca2+浓度显著上升,并在随后的一系列凋亡改变中起关键性作用。3线粒体损伤:在细胞凋亡期间,尽管线粒体能维持其超微结构的基本正常,但事实上其功能已发生显著改变,有证据显示,线粒体功能改变在细胞凋亡的发生中起关键作用,因为抑制线粒体的三羧酸循环或呼吸链功能即可引起细胞凋亡;在细胞核出现凋亡性改变之前,常常先有线粒体跨膜电位的降低。

3.6细胞凋亡的检测理论、技术与方法

研究中透视电镜进行形态学观察仍是鉴定细胞凋亡的金标准。常规染色方法有苏木素-伊红(HE染色)、Papanicolaou法染色、以及Giemsa染色等。检测细胞凋亡的方法及原理:针对细胞凋亡的生化特征发展了检测凋亡的方法,如琼浆糖凝胶电泳法、原位末端标记法、酶联免疫吸附法(ELISA法)、双重荧光色素法、线粒体△Ψm测定、膜联蛋白ⅴ-FITC/PI法、Caspases活性检测、流式细胞术、TUNEL法、DNA 阶梯检测和DNA含量分析法等。另外,一些基因在细胞凋亡时表达异常,检测这些特异基因的表达水平也是判断细胞凋亡的手段之一。一般多采用Northern杂交和RT-PCR对这些凋亡相关基因进行检测。如可通过检测fasfasLbaxalphabclXL等凋亡相关基因的mRNA表达水平来进行细胞凋亡的检测。近年来,荧光定量PCR技术发展迅速,检测基因表达水平更快、更准确。多种针对特定的凋亡途径的检测方法亦发展很快,如抗体法,酶活性测定等。目前参与调控凋亡的基因多达数十种,大致分为凋亡抑制基因(其中研究最多最为透彻的时bcl2),凋亡抑制基因如baxfas以及双向调节基因如cmyc等。这些方法具有很高的特异性和敏感性,为细胞凋亡的研究提供了强有力的工具和手段。有许多基因参与调节睾丸生殖细胞的凋亡过程,所有的与凋亡相关的基因产物都存在于人类睾丸中。细胞凋亡是在基因控制下的细胞自我消亡过程。许多实验提示细胞凋亡涉及一个基因表达的级联反应。睾丸生殖细胞的凋亡同细胞的增殖分化一样受多种基因控制。凋亡相关基因分为凋亡刺激基因和凋亡抑制基因。它们表达的基因产物具有协同作用或拮抗作用,维持着一种动态平衡,共同控制着生精细胞的凋亡。

4 缺血再灌注损伤与细胞凋亡

研究表明,在缺血再灌注损伤时除坏死外,还存在另一种细胞死亡形式即细胞凋亡,且可能在I/R损伤中的病理过程起重要作用。许多学者都发现了细胞凋亡在脑[12,20]、心[2122][23,24]、肝[25]I/R损伤中的作用。睾丸扭转复位对其功能的损伤是一种缺血再灌注(ischemia / reperfusion,  I / R)损伤,睾丸I/R后产生的氧自由基和局部中性粒细胞的聚集在生殖细胞的凋亡中起重要作用[26]。急性睾丸扭转/复位是一个涉及睾丸缺血再灌注的病理过程。在此过程中将产生大量活性氧(reactive oxygen species, ROS) 。这些ROS作用于细胞膜后产生的趋化物质吸引大量中性粒细胞到I/R地带,释放更多的ROS,产生再灌注损伤。ROS被认为在I/R损伤引起的凋亡中起重要作用[27],并且ROS能直接破坏线粒体的功能和刺激凋亡发生[28,29],睾丸组织中的抗氧化酶体系则通过清除过量生成的ROS而抑制凋亡,这可能对减轻ROS的毒性作用至关重要。睾丸扭转术后组织中抗氧化酶活性明显下降,说明此时抗氧化酶系统己遭破坏,过量生成的ROS启动了凋亡程序。氧自由基大量产生是目前公认的缺血再灌注损伤(I/R)的主要机制之一[30],缺血一再灌注时,导致的组织细胞损伤主要与氧自由基大量产生细胞Na+K+ATP酶活性降低及细胞内钙超载等有关[31],因缺血而损伤的细胞不能完全利用氧,多余的氧被单电子还原成负氧离子(0- 2)、过氧化氢(H2O2 )等,随着细胞内氧的大量涌入,氧自由基呈爆发性增加。期间大量氧自由基使脂质过氧化反应加剧,对精子功能产生重大影响,研究表明睾丸扭转的缺血一再灌注损伤主要导致精原细胞凋亡增加,这是造成生精能力受损的重要原因[32]ROS的激发凋亡的作用可以从氧自由基清除剂能预防和减轻睾丸扭转后生精作用丧失结果中得到证实,Tuner[33]指出,这种ROS诱导的睾丸干细胞凋亡具有特异性。Sertoli细胞和Leydig细胞由于抗ROS损害强而未导致凋亡,即Sertoli细胞的蛋白合成分泌和Leydig细胞的睾酮合成作用未受影响。同时也说明这种干细胞特异的凋亡与睾酮关系明显,与生理条件下启动的凋亡因素是有区别的。ROS诱导细胞凋亡的具体分子理论尚不十分清楚,组织缺血、缺氧后,体内氧自由基的生成和清除系统动态平衡被打破,抗氧化酶如SOD, GSH-PX等被大量消耗,而氧自由基储积增多,引起脂质过氧化反应,一方面使细胞膜形成多个芽突,降低细胞膜流动性,影响精子生理功能;另一方面由于生物膜脂双层结构主要成份是不饱和脂肪酸((PUFA),其中>C=C<双键最易受氧自山基攻击,引起脂质过氧化,造成膜通透性增加,Ca2+内流并激活细胞凋亡关键酶-内源性 Ca2+/ Mg2+依赖性核酸内切酶,进而使精子核内DNA断裂形成DNA片段[34],氧自由基还可通过介导线粒体渗透性转换孔的开放,使线粒体内环境失衡而引起线粒体膨胀,导致线粒体外膜破裂,膜间腔内细胞色素C和凋亡诱导因子释放入胞质,进一步激活Capase-3,诱导生殖细胞凋亡[35];近年研究表明,生精细胞的凋亡与组织中抗氧化酶活性相关[33,36]。抗氧化酶类的活性相互协调、相互影响,SOD活性的降低会造成CAT活性的降低,而CAT是组织细胞中H2O2主要的清除剂,CAT活性的降低会造成H2O2水平的升高而诱发生精细胞凋亡。因此,抗氧化酶系统失调导致生精细胞凋亡,而cat活性的降低是生精细胞发生过度凋亡的关键因素。内源性的ROS是生精细胞凋亡的决定因素,而H2O2是生精细胞发生凋亡的主要诱因。抗氧化酶类可通过清除组织中过多的ROS使生精细胞凋亡的发生率显著降低[37]。急性睾丸扭转,即使没有睾丸组织的梗死出现,缺血后的睾丸血供也可恢复至正常水平,但仍可出现睾丸生精功能但损害核生育能力降低。这种损害作用是由于睾丸缺血再灌注后细胞凋亡所致,并且这种损害作用是可以预防和治疗的。

5钙离子通道阻滞剂对缺血再灌注损伤组织的保护作用

在再灌注前或再灌注即刻应用钙拮抗剂,可抑制细胞内钙超载,减轻再灌注损伤。维拉帕米是选择性作用于细胞膜L型通道的药物,可减少细胞内Ca2+内流,减轻缺血-再灌注时细胞内钙超载。从本研究及以往文献报道[38]。可以看出维拉帕米可以减轻缺血再灌注损伤引起的细胞凋亡及保护扭转复位后扭转侧睾丸的生精功能。

6 低温在缺血再灌注损伤中的保护作用

低温保护技术已被广泛应用于缺血再灌注损伤的救治,对肾脏采取原位低温技术可延长肾耐受缺血时间,减轻肾组织及肾功能损伤[38] Peron等证实低温对大鼠睾丸扭转后的精原细胞有明显保护作用[39] Miller[40]证实,在大鼠睾丸缺血模型中,缺血30min运用低温保护共4h可保留90%的生精上皮,6h可保留85%的生精上皮。如果不经过低温处理,缺血后4h只能保留25%的生精上皮;6h则只保留了8%的生精上皮。Sarica[41]等研究发现低温对扭转致缺血的大鼠睾丸组织和精曲小管有保护作用。低温保护作用的机制可能有如下几点:1减少ATP的消耗;2降低基础代谢率及氧需求量;3减少细胞膜的通透性,低温可以减少ATP的消耗,而ATP对维持细胞膜的完整性有重要的意义;4减轻氧自由基对细胞的损害,MDA作为脂质过氧化代谢终产物,其含量的增高常被用来评价细胞或组织受自由基损, 伤的严重程度,SOD是体内自由基的重要清除酶,其活性升高表明机体自由基清除加快,MDA含量显著降低说明低温可以减轻氧自由基对细胞的损伤。由此我们通过建立大鼠单侧睾丸扭转模型,给予扭转侧睾丸低温保护技术来减轻缺血再灌注对它的损伤,探讨低温对睾丸扭转复位后生精功能的影响。

7 防治缺血再灌注损伤的其他方法

减轻缺血性损伤是防治再灌注损伤的基础,应针对缺血原因,采取有效措施,缩短组织缺血时间,尽早恢复血流。多次短暂缺血预处理可以增强细胞对缺血的耐受性,是调动机体内源性保护机制的有效措施。控制再灌注条件,采用低压、低流、低pH、低钠及低钙、灌注液、低温可减轻再灌注损伤;清除自由基:机体对抗自由基损伤的防护体系主要有两大类:低分子自由基清除剂和酶性清除剂。1低分子清除剂分为存在于细胞脂质部分的自由基清除剂如维生素E和维生素A等,和存在于细胞内外水相中的自由基清除剂,如半胱氨酸、抗坏血酸、还原型谷胱苷肽和NADPH等。2酶性清除剂,过氧化氢酶及过氧化物酶存在于细胞内,可以清除H2O2,以避免高毒性OH.的产生;超氧化物歧化酶对机体的氧化和抗氧化平衡起着重要作用,超氧化物歧化酶可以歧化O2-生成H2O2保护细胞免受损伤;改善缺血组织的代谢:缺血组织在有氧代谢下,糖酵解过程增强,因而补充糖酵解底物如磷酸几糖有保护缺血组织的作用。外源性ATP作用于细胞表面与ATP受体结合,可使细胞膜蛋白磷酸化,有利于细胞膜功能的恢复,并可穿过细胞膜进入细胞直接供能。针对线粒体损伤所致的氧化磷酸化受阻,可以应用氢醌、细胞色素C等治疗,延长缺血组织的可逆性改变期限;另外,I/R损伤的发生可能与氧自由基损伤、细胞内钙超载、能量衰竭、白细胞激活及内皮细胞损伤等有关[43],而药物则能对再灌注损伤所导致的细胞凋亡起到减轻作用。早期药物应用可减少生精上皮的变性坏死。如应用别嘌呤醇能抑制局部即刻产生的大量氧自由基,从而减少细胞坏死,另外地塞米松、谷胱苷肽、维生素Esodm40403(非肽类的sod)、咖啡酸苯乙酯(cape,一种抗氧化和抗感染药[44]、高压氧[45])中药(葛根素、刺五加、川穹嗪银杏叶提取物)等在睾丸扭转复位引起的I/R损伤及抑制细胞凋亡中有重要作用。

在本研究中,我们采用了流式细胞术做双变量散点图并计算睾丸细胞凋亡百分比,可以看出相比于e组,A组左侧睾丸细胞凋亡百分比升高,B组、C组、D组较A组左侧睾丸细胞凋亡百分比减低,D组较B组及C组左侧睾丸细胞凋亡百分比减低,B组与C组间差异无统计学意义(P>0.05,提示维拉帕米、低温可以减少睾丸扭转复位后细胞凋亡,二者单独作用无明显差异,二者联合应用有协同作用。

在该试验中我们还采用了Makler评分法评价睾丸生精功能。将睾丸标本制成石蜡切片,放在带目镜测微尺的显微镜下,测量曲细精管内径、管周膜厚度、管壁生殖细胞层数及生殖细胞成熟程度,这从微观方面反映了睾丸生精功能。因为曲细精管内径的缩小,再加上不成熟生精细胞的脱落,很容易导致继发性梗阻性无精子症的发生。近年来,十分重视管周膜即界膜的病理变化。它主要由基底膜、管周平滑肌细胞等构成。其中管周平滑肌细胞有收缩功能,细胞的收缩有助于精子的排放。管周膜的纤维化、增厚可影响收缩功能及精子的排放[46,47]。生殖细胞层数及生殖细胞的成熟程度是评价翠丸生精功能的重要指标。生精功能低下时,精原细胞发育至成熟精子的某个阶段而阻滞,表现为生殖细胞层数减少和生殖细胞的成熟程度降低。从本研究可看出,相比于E组左侧睾丸,A组左侧睾丸曲细精管内径缩小,管壁生殖细胞层数减少,生殖细胞成熟障碍,makler评分降低(p<0.05)。这也提示,睾丸扭转复位后,虽然恢复了血供,睾丸亦没有出现梗死,但生精功能仍然受损,生精功能较正常者显著降低。B组、C组、D组较A组左侧睾丸TMS升高,D组较B组及C组左侧睾丸TMS升高,B组与C组间差异无统计学意义(P>0.05,提示维拉帕米、低温可以提高睾丸扭转复位后同侧睾丸的生精功能,二者单独作用无明显差异,二者联合应用有协同作用。

由于活性氧很难直接测定,通常用活性氧引起的脂质过氧化产物MDA来间接表示活性氧的多少[48-50]SOD CAT GSHPX活性来表示睾丸的抗氧化能力,从本研究中可以看出,相比于对照组,A组左侧睾丸活性氧含量增加,组织抗氧化能力下降,B组、C组、D组较A组左侧睾丸活性氧含量减少,组织抗氧化能力升高,D组较B组及C组左侧睾丸活性氧含量减少,组织抗氧化能力升高,B组与C组间差异无统计学意义(P>0.05,提示维拉帕米、低温可以减少睾丸扭转复位后活性氧的释放提高睾丸组织的抗氧化能力,二者单独作用无明显差异,二者联合应用有协同作用。

由上而知,睾丸扭转复位后活性氧含量增多及抗氧化能力下降导致细胞凋亡增加可能是导致睾丸生精功能受损的原因,维拉帕米、低温因素对扭转侧睾丸均可降低活性氧含量、提高抗氧化能力、减轻凋亡,对扭转侧睾丸生精功能有保护作用,二者联合应用其作用可以协同。

综上所述,睾丸扭转复位后可导致缺血再灌注损伤,在复位前对睾丸运用低温保护技术,可提高扭转睾丸的耐缺血能力,在一定程度上减轻睾丸组织的缺血再灌注损伤,提高睾丸的生存能力。同时维拉帕米也能减轻睾丸组织的缺血再灌注损伤。二者作为协同作用,降低组织代谢及ATP的消耗,减轻钙超载,从而减轻再灌注时自由基的产生量,提高组织的抗氧化能力,减轻自由基对组织损伤的作用,提高对自由基的清除能力,减轻生精细胞的凋亡,提高复位睾丸的生精功能,因此,我们可以考虑在睾丸扭转患者得到确诊至手术前用冰袋将其覆盖,尽可能减少睾丸的损害,复位时应用钙离子拮抗药物,对挽救睾丸扭转患者的生育功能有重要意义。

由于睾丸扭转复位所致睾丸生精功能的损害的机制很复杂,且影响因素较多,例如还有免疫因素、神经因素等,该研究仅对维拉帕米、低温对扭转侧睾丸的生精功能进行了研究,对侧睾丸的生精功能尚没进行观察,进一步观察它们对睾丸扭转复位后生精功能的保护作用对泌尿外科医师来说也颇为重要。


  

1. 睾丸扭转复位后扭转侧睾丸明显受损,生精功能减低。

2. 低温、维拉帕米因素单独作用于扭转后复位的睾丸均能减轻缺血再灌注对睾丸的损伤程度,保护生精功能,二者作用基本相似

3. 低温与维拉帕米因素共同作用于扭转侧复位睾丸能明显减轻缺血再灌注的损害程度,保护睾丸的生精功能。

4. 低温、维拉帕米因素共同作用较单独作用时效果更明显。

5. 缺血再灌注损伤可能是睾丸扭转复位后生精细胞凋亡、生精功能减低的机理之一。


附图表

1 扭转组扭转侧睾丸组织HE 染色(×100

2 维拉帕米组扭转侧睾丸组织HE 染色(×100


            

3 低温组扭转侧睾丸组织HE 染色(×100

4 维拉帕米+低温组扭转侧睾丸组织HE 染色(×100


5 对照组扭转侧睾丸组织HE 染色(×100

6 各组大鼠手术侧睾丸细胞凋亡百分比(± s

组别

n

细胞凋亡百分比

扭转组

6

0.3211±0.022*

维拉帕米组

6

0.2018±0.015*※★

低温组

6

0.2002±0.019*※★

维拉帕米+低温组

6

0.1375±0.014*

对照组

6

0.0856±0.009

注:与对照组比较:*P<0.01;与扭转组比较:P<0.01

与维拉帕米+低温组比较:P<0.01


7 扭转组扭转侧睾丸细胞双变量散点图

8 维拉帕米组扭转侧睾丸细胞双变量散点图

9 低温组扭转侧睾丸细胞双变量散点图


10 维拉帕米+低温组扭转侧睾丸细胞双变量散点图

11 对照组扭转侧睾丸细胞双变量散点图

12各组大鼠扭转侧睾丸组织SODCATMDAGSHPX结果(± s

组别

n

Sod

U/mg prot

Mda

nmol/mgprot

Cat

u/mgprot

GSHPX

u/mgprot

扭转组

6

96.59±6.28

38.39±0.56

17.26±3.58

10.71±1.29

维拉帕米组

 6

105.65±1.37*※★

15.70±0.90*※★

33.35±2.86*※★

23.35±3.01*※★

低温组

6

103.87±4.52▲★

14.79±0.81*※★

31.46±3.82*※★

20.61±4.07*※★

维拉帕米+低温组

6

123.89±9.41*※

9.59±0.74*※

38.12±2.79*※

45.29±1.76*※

对照组

6

131.41±2.67

5.99±0.71

46.35±3.64

71.04±0.72

注:与对照组比较:P<0.01;与扭转组比较:P<0.01, ▲P<0.05;

与维拉帕米+低温组比较:P<0.01

13 各组大鼠扭转侧睾丸TMS(±s)

组别

n

TMS

扭转组

6

14.47±1.35

维拉帕米组

6

15.45±0.75*※★

低温组

6

15.48±0.75*※★

维拉帕米+低温组

6

16.22±0.72*※

对照组

6

19.60±0.56

注:与对照组比较:P<0.01;与扭转组比较:P<0.01;与维拉帕米+低温组比较:P<0.01

        

注:与对照组比较:P<0.01;与扭转组比较:P<0.01, P<0.05;

与维拉帕米+低温组比较:P<0.01

14 各组SOD活力检测结果直条图

  

   

  

       ※★       *※★       

                             

注:与对照组比较:P<0.01;与扭转组比较:P<0.01,;

与维拉帕米+低温组比较:P<0.01

15 各组MDA含量检测结果直条图

                            

          ※★       *※★    

   

注:与对照组比较:P<0.01;与扭转组比较:P<0.01,;

与维拉帕米+低温组比较:P<0.01

16 各组CAT活力检测结果直条图

                         

           ※★       *※★

注:与对照组比较:P<0.01;与扭转组比较:P<0.01,;

与维拉帕米+低温组比较:P<0.01

17 各组GSHPX活力检测结果直条图

             

        ★        ★          

                          

                               

注:与对照组比较:P<0.01;与扭转组比较:P<0.01,;

与维拉帕米+低温组比较:P<0.01

18 各组TMS直条图

       

 ※★      *※★         

注:与对照组比较:P<0.01;与扭转组比较:P<0.01,;

与维拉帕米+低温组比较:P<0.01

19 各组扭转侧睾丸细胞凋亡百分比直条图


20 各组左侧睾丸CAT活性方差分析表

方差来源

SS

df

MS

F

P

组间

2726.24

4

681.56

60.25

<0.001

组内

282.79

25

11.31

3009.03

29

 

 

 

21 各组左侧睾丸MDA含量方差分析表

方差来源

SS

df

MS

F

P

组间

3841.80

4

960.45

1197.32

<0.001

组内

20.05

25

.80

3861.85

29

 

 

 

22 各组左侧睾丸SOD活力方差分析表

方差来源

SS

df

MS

F

P

组间

5171.03

4

1292.75

41.07

<0.001

组内

786.76

25

31.47

5957.79

29

 

 

 

23各组左侧睾丸GSHPX活力方差分析表

方差来源

SS

df

MS

F

P

组间

14010.11

4

3502.53

566.51

<0.001

组内

154.56

25

6.18

14164.67

29

 

 

 

24各组左侧睾丸凋亡百分比方差分析表

方差来源

SS

df

MS

F

P

组间

0.186

4

0.04

173.93

<0.001

组内

0.007

25

3.51

0.193

29

0.000268

 

 

25各组左侧睾丸TMS方差分析表

方差来源

SS

df

MS

F

P

组间

937.88

4

234.47

312.48

<0.001

组内

221.35

25

0.75

1159.23

29

 

 

 

26 各组左侧睾丸MDA含量两两比较分析表

组别

组别

平均差(mean difference

标准误
Std. Error

P

扭转组

维拉帕米组

22.6938851

0.51709613

<0.001

低温组

23.6079904

0.51709613

<0.001

维拉帕米+低温组

28.8013834

0.51709613

<0.001

对照组

32.4028072

0.51709613

<0.001

维拉帕米组

扭转组

-22.6938851

0.51709613

<0.001

低温组

0..9141052

0.51709613

0.089

维拉帕米+低温组

6.1074982

0.51709613

<0.001

对照组

9.7089220

0.51709613

<0.001

低温组

扭转组

-23.6079904

0.51709613

<0.001

维拉帕米组

-0.9141052

0.51709613

0.089

维拉帕米+低温组

5.1933929

0.51709613

<0.001

对照组

8.7948167

0.51709613

<0.001

维拉帕米+低温组

扭转组

-28.8013834

0.51709613

<0.001

维拉帕米组

-6.1074982

0.51709613

<0.001

低温组

-5.1933929

0.51709613

<0.001

对照组

3.6014238

0.51709613

<0.001

对照组

扭转组

--32.4028072

0.51709613

<0.001

维拉帕米组

-9.7089220

0.51709613

<0.001

低温组

-8.7948167

0.51709613

<0.001

 

维拉帕米+低温组

-3.6014238

0.51709613

<0.001


27 各组左侧睾丸CAT活性两两比较分析表

组别

组别

平均差(mean difference

标准误
Std. Error

P

扭转组

维拉帕米组

-16.09162890

1.941815

<0.001

低温组

-14.20526790

1.941815

<0.001

维拉帕米+低温组

-20.86561027

1.941815

<0.001

对照组

-29.09515012

1.941815

<0.001

维拉帕米组

扭转组

16.09162890

1.941815

<0.001

低温组

1.88636100

1.941815

0.341

维拉帕米+低温组

-4.77398137

1.941815

0.021

对照组

-13.00352122

1.941815

<0.001

低温组

扭转组

14.20526790

1.941815

<0.001

维拉帕米组

-1.88636100

1.941815

0.341

维拉帕米+低温组

-6.66034237

1.941815

0.002

对照组

-14.88988222

1.941815

<0.001

维拉帕米+低温组

扭转组

20.86561027

1.941815

<0.001

维拉帕米组

4.77398137

1.941815

0.021

低温组

6.66034237

1.941815

0.002

对照组

-8.22953985

1.941815

<0.001

对照组

扭转组

29.09515012

1.941815

<0.001

维拉帕米组

13.00352122

1.941815

<0.001

低温组

14.88988222

1.941815

<0.001

 

维拉帕米+低温组

8.22953985

1.941815

<0.001

28 各组左侧睾丸SOD活力两两比较分析表

组别

组别

平均差(mean difference

标准误
Std. Error

P

扭转组

维拉帕米组

-9.05444033

3.23886393

0.010

低温组

-7.27562072

3.23886393

0.034

维拉帕米+低温组

-27.29376619

3.23886393

<0.001

对照组

-34.82591130

3.23886393

<0.001

维拉帕米组

扭转组

9.05444033

3.23886393

0.010

低温组

1.77881961

3.23886393

0.588

维拉帕米+低温组

-18.23932587

3.23886393

<0.001

对照组

-25.77147097

3.23886393

<0.001

低温组

扭转组

7.27562072

3.23886393

0.034

维拉帕米组

-1.77881961

3.23886393

0.588

维拉帕米+低温组

-20.01814547

3.23886393

<0.001

对照组

-27.55029058

3.23886393

<0.001

维拉帕米+低温组

扭转组

27.29376619

3.23886393

<0.001

维拉帕米组

18.23932587

3.23886393

<0.001

低温组

20.01814547

3.23886393

<0.001

对照组

-7.53214510

3.23886393

0.028

对照组

扭转组

34.82591130

3.23886393

<0.001

维拉帕米组

25.77147097

3.23886393

<0.001

低温组

27.55029058

3.23886393

<0.001

 

维拉帕米+低温组

7.53214510

3.23886393

0.028

29各组左侧睾丸TMS两两比较分析表

组别

组别

平均差(mean difference

标准误
Std. Error

P

扭转组

维拉帕米组

-0.983333333

0.158149611

<0.001

低温组

-1.016666667

1.158149611

<0.001

维拉帕米+低温组

-1.75

2.158149611

<0.001

对照组

-5.133333333

3.158149611

<0.001

维拉帕米组

扭转组

0.983333333

4.158149611

<0.001

低温组

-0.033333333

5.158149611

0.833

维拉帕米+低温组

-0.766666667

6.158149611

<0.001

对照组

-4.15

7.158149611

<0.001

低温组

扭转组

1.016666667

8.158149611

<0.001

维拉帕米组

0.033333333

9.158149611

0.833

维拉帕米+低温组

-0.733333333

10.15814961

<0.001

对照组

-4.116666667

11.15814961

<0.001

维拉帕米+低温组

扭转组

1.75

12.15814961

<0.001

维拉帕米组

0.766666667

13.15814961

<0.001

低温组

0.733333333

14.15814961

<0.001

对照组

-3.383333333

15.15814961

<0.001

对照组

扭转组

5.133333333

16.15814961

<0.001

维拉帕米组

4.15

17.15814961

<0.001

低温组

4.116666667

18.15814961

<0.001

 

维拉帕米+低温组

3.383333333

19.15814961

<0.001

30各组左侧睾丸GSHPX活力两两比较分析表

组别

组别

平均差(mean difference

标准误
Std. Error

P

扭转组

维拉帕米组

-12.6419029

1.43557164

<0.001

低温组

-9.8966888

1.43557164

<0.001

维拉帕米+低温组

-34.5771612

1.43557164

<0.001

对照组

-60.3390870

1.43557164

<0.001

维拉帕米组

扭转组

12.6419029

1.43557164

<0.001

低温组

2.7452140

1.43557164

0.067

维拉帕米+低温组

-21.9352583

1.43557164

<0.001

对照组

-47.6971841

1.43557164

<0.001

低温组

扭转组

9.8966888

1.43557164

<0.001

维拉帕米组

-2.7452140

1.43557164

0.067

维拉帕米+低温组

-24.6804723

1.43557164

<0.001

对照组

-50.4423981

1.43557164

<0.001

维拉帕米+低温组

扭转组

34.5771612

1.43557164

<0.001

维拉帕米组

21.9352583

1.43557164

<0.001

低温组

24.6804723

1.43557164

<0.001

对照组

-25.7619257

1.43557164

<0.001

对照组

扭转组

60.3390870

1.43557164

<0.001

维拉帕米组

47.6971841

1.43557164

<0.001

低温组

50.4423981

1.43557164

<0.001

 

维拉帕米+低温组

25.7619257

1.43557164

<0.001

31各组左侧睾丸凋亡百分比两两比较分析表

组别

组别

平均差(mean difference

标准误
Std. Error

P

扭转组

维拉帕米组

0.119233

0.0094524

<0.001

低温组

0.1209

0.0094524

<0.001

维拉帕米+低温组

0.183567

0.0094524

<0.001

对照组

0.2355

0.0094524

<0.001

维拉帕米组

扭转组

-0.119233

0.0094524

<0.001

低温组

0.001667

0.0094524

0.861

维拉帕米+低温组

0.064333

0.0094524

<0.001

对照组

0.116267

0.0094524

<0.001

低温组

扭转组

-0.1209

0.0094524

<0.001

维拉帕米组

-0.001667

0.0094524

0.861

维拉帕米+低温组

0.062667

0.0094524

<0.001

对照组

0.1146

0.0094524

<0.001

维拉帕米+低温组

扭转组

-0.183567

0.0094524

<0.001

维拉帕米组

-0.064333

0.0094524

<0.001

低温组

-0.062667

0.0094524

<0.001

对照组

0.051933

0.0094524

<0.001

对照组

扭转组

-0.2355

0.0094524

<0.001

维拉帕米组

-0.116267

0.0094524

<0.001

低温组

-0.1146

0.0094524

<0.001

 

维拉帕米+低温组

-0.051933

0.0094524

<0.001


32曲细精管内径评分标准

曲细精管内径D(μm)

得分

150250μm

5

100150μm

4

75100μm

3

5075μm

2

2550μm

1

<25μm

0

33管周膜厚度评分标准

管周膜厚度M

得分

<3μm

5

3 5μm

4

57μm

3

710μm

2

1013μm

1

>13μm

0

34管壁生殖细胞层数评分标准

管壁生殖细胞层数P

得分

>4

5

34

4

2 3

3

12

2

1

1

0

0

35 生殖细胞成熟程度评分标准

生殖细胞成熟程度S

得分

有成熟精子

5

阻滞在精子细胞阶段

4

阻滞在次级精母细胞阶段

3

初级精母细胞阶段

2

精原细胞阶段

1

仅有支持细胞

0


参考文献

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