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基础医学
低温及维生素E对大鼠睾丸扭转复位后生精功能的保护作用
添加时间: 2019-11-1 12:10:17 来源: 作者: 点击数:569

      

  

东营市人民医院(山东省立医院集团东营医院)

科技计划项目申请书

项目编号                             

项目名称低温及维生素E对大鼠睾丸扭转复位后生精功能的保护作用

                                        

东营市人民医院(山东省立医院集团东营医院)科教科



一、简表

姓名

性别

出生年月

职务

职    称

副主任医师

学    历

研究生

学位

硕士

毕业学校

潍坊医学院

所学专业

泌尿外科

研究方向

泌尿男科学

科    室

泌尿外科

联系电话

 

E-Mail

 

项目情况

项目名称

低温及维生素E对大鼠睾丸睾丸扭转复位后生精功能的保护作用

所属学科

名称1

泌尿外科

名称2

病理科

起止时间

2016年02月 至2018年01月

研究

内容

摘要(200字内)

本实验首先制备青春期大鼠睾丸扭转模型,通过采用不同的方法对大鼠一侧睾丸扭转模型进行处理,探讨维生素E、低温联合应用对大鼠睾丸扭转复位后缺血-再灌注损伤、生殖细胞的凋亡及睾丸生精功能的影响。并通过该试验和对以往文献的分析探讨睾丸扭转复位后生精细胞的损害机制以及不同影响因素对睾丸扭转复位后保护效果的比较,为其临床治疗和预防提供理论依据。

主题词

睾丸扭转;缺血-再灌注损伤;细胞凋亡;流式细胞术


三、项目组成员登记表

四、本研究的立项依据

1.研究意义

睾丸扭转是泌尿外科急症之一,是指精索沿其纵轴旋转,精索内血液循环产生障碍,导致睾丸缺血、甚至坏死。此病由Delasiauve于1840年首次报告。既往发病率不高,近30年来发病率明显上升[1]。Barada等人[2]报告25岁以下的男性发病率高达1/4000。因此本病并非少见,应引起临床医师高度重视。该病多见于青春前期及青春期,若治疗不及时常导致睾丸功能损伤和低生育症。随着对该病的重视和新的诊断技术(如Dopplor超声,核素扫描)的应用,早期诊断和手术复位患者增加,复位睾丸的存活率大大提高。

研究大量临床资料发现,术后仍有相当一部分患者出现患侧睾丸萎缩和无功能、生精能力低下、精子活动力差,甚至对侧睾丸功能亦受到影响,从而导致男子不育 [5-7]

研究表明,睾丸扭转复位后引起睾丸的缺血再灌注(ischemia /reperfusion,I/R)过程,该过程进而引起睾丸生殖细胞凋亡增加,其发生与氧自由基的损伤密切相关,组织缺血、缺氧后,体内氧自由基的生成和清除系统动态平衡被打破。抗氧化酶如SOD, GSH-PX等被大量消耗,而氧自由基储积增多,引起脂质过氧化反应,影响精子生理功能并诱导生殖细胞凋亡;其发生还与缺血再灌注后引起的Ca2+内流密切相关,组织缺血时,由于缺氧、底物供应缺乏及利用障碍,致ATP生成减少,影响跨膜离子转运。ATP缺乏导致Na+. Ca2+入胞,K+出胞,同时由于Na+-K+-ATP酶失活,因而Ca2+在胞浆内及线粒体内储留。细胞内钙离子既是损伤因子,又可能充当第二信使细胞内游离钙超载时[8],激活钙离子依赖性核酸内切酶,从而使双链DNA在核小体Linker部位裂解,形成DNA裂片。另一方面,钙超载时可活化蛋白酶C,令其转移至细胞膜,使G蛋白磷酶化,G蛋白减少,胞内cAMP增加,导致细胞凋亡。此外,细胞内Ca2+增加可通过增Ca2+依赖性蛋白酶活性,加速黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶,从而促进氧自由基的生成。许多方法(包括物理和化学方法)被应用于治疗睾丸I/R损伤,如低温、睾丸激素、别嘌呤醇、维生素E、soD、m40403(非肽类的sod)、咖啡酸苯乙酯(cape,一种抗氧化和抗感染药)、高压氧、中药葛根素、刺五加、川穹嗪银杏叶提取物等,这些疗法均有一定的疗效。

2.国内外研究现状 :

为了给本病的临床提供充足必要的理论依据,更好地保护睾丸扭转病人的生育能力,很多学者对其进行了大量深入的研究。

低温保护技术已被广泛应用于缺血再灌注损伤的救治,对肾脏采取原位低温技术可延长肾耐受缺血时间,减轻肾组织及肾功能损伤[9], Peron等证实低温对大鼠睾丸扭转后的精原细胞有明显保护作用[10]。 Miller[11]证实,在大鼠睾丸缺血模型中,缺血30min运用低温保护共4h可保留90%的生精上皮,6h可保留85%的生精上皮。如果不经过低温处理,缺血后4h只能保留25%的生精上皮;6h则只保留了8%的生精上皮。Sarica[12]等研究发现低温对扭转致缺血的大鼠睾丸组织和精曲小管有保护作用。低温保护作用的机制可能有如下几点:1减少ATP的消耗;2降低基础代谢率及氧需求量;3减少细胞膜的通透性,低温可以减少ATP的消耗,而ATP对维持细胞膜的完整性有重要的意义;4减轻氧自由基对细胞的损害,MDA作为脂质过氧化代谢终产物,其含量的增高常被用来评价细胞或组织受自由基损伤的严重程度,SOD是体内自由基的重要清除酶,其活性升高表明机体自由基清除加快,MDA含量显著降低说明低温可以减轻氧自由基对细胞的损伤。

维生素 E,是一种广为人知的抗氧化维生素,主要作用于膜结构的脂溶性抗氧化剂,在人体睾丸、大脑、心脏等各个脏器都有分布,尤其在大脑及睾丸,是机体各脏器维生素 E 含量最为丰富之处[13],近年来随着对维生素 E 研究的展开,发现维生素 E 除了抗氧化能力突出外,也参与体内众多调控反应。并且维生素 E 毒性报告极少,其中毒剂量大,对人体的安全性不言可知,更易于临床应用,尤其是使用维生素 E 来改善各动物组织 IRI 都取得满意效果。国外学者在使用维生素 E 对抗在心、肝、肌肉及肾脏[14-17]等组织 IRI 的实验中,维生素 E 抗氧化、抑制炎症因子、促进体内自身抗氧化能力的提高等作用都得到明确表现。而国内对于维生素 E 在缺血再灌注中的研究,除心脏、脑等方面尚可见些许研究外,应用于其他组织的相关研究少有报道,尤其是泌尿生殖系统器官。

    鉴于目前对睾丸缺血再灌注损伤的研究均为单一因素的保护性治疗作用,多种因素混合作用下的保护作用的研究相对较少,而且对单因素作用及多因素作用保护效果有无差异还缺少这方面的探讨。

3.本项目创新之处:

本实验建立大鼠睾丸扭转动物模型,进行不同的处理,测定各组mda含量、sod、cat、GSHPX活性、睾丸细胞凋亡百分比及睾丸的生精功能(TMS),探讨维生素E、低温在大鼠睾丸扭转复位后睾丸I/R损伤中的保护作用,以及各组间作用的差异。探讨多种保护因素的共同作用对减少睾丸损伤的作用效果,探讨能减轻再灌注损伤的最佳方法,既提高睾丸手术复位后的生存力,又能提高复位睾丸的生理功能,为临床治疗提供理论依据。

4,参考文献

[1]贾汝汉,张孝斌,李明.泌尿生殖系统急诊[M].北京:人民卫生出版社,2000: 554-557.

[2]Barada JH, Weingarten JL, Cromie WJ. Testicular salvage and age-related delay in the presentation of testicular torsion[J]. J Uro1, 1989, 142(3):746-748.

[3]Saba M, Morales CR, Lamirande ED, et al. Morphological and biochemical changes following acute unilateral testicular torsion in prepubertal rats[J].J Uro1, 1997, 157(3): 1149-1154.

[4]Turner TT. On unilateral testicular and epididymal torsion: no effect on the contralateral testis[J]. J Uro1,1987,I38(5):I2851290.

[5]Prillaman HM, Turner TT. Rescue of testicular function after acute experimental torsion [J]. J Uro1, 1997, 157(1):340-345.

[6]Lysiak JJ, Nguyen QA, Turner TT.  Peptide and nonpeptide reactive oxygen scavengers provide partial rescue of the testis after torsion[J]. J Andro1, 2002, 23(3) :400-409.

[7] Turner TT, Tung KSK, Tomomasa H, et al. Acute testicular ischemia results in germ cell-specific apoptosis in the rat[J]. Biol Reprod, 1997, 57:1267-1274.

[8].Yeh ET. Life and death in the cardiovascular system .Circulation 1997, 95: 785-790.

[9] 王浩,王常林,王伟,等,兔睾丸扭转复位后睾丸细胞凋亡的观察[J].中华小儿外科杂志,2002236):543545.

[10] 胡礼泉、郑新民、李世文,等.两种原位低温肾手术的对照性实验研究[[J].中华泌尿外科杂志,1983, 4 (3) : 133-135.

[11] Peron SE, Klugo RC, Cerny JC. Effects of hypothermia on testicular spermatogenesis following chemotherapy. Surg Forum 1984; 35:630.

[12]Miller DC, Peron SE, Keck RW, et al. Effects of hypothermia on testicular ischemia.J Urol 1990, 143(5):1046-1048.

[13]  葛可佑主编.中国营养学科全书[M].北京:人民卫生出版社,2004.

[14]  Evans  ZP,  Mandavilli  BS,  Ellett  EP,  et  al.  Vitamin  E  Succinate  Enhances  Steatotic  Liver Energy  Status  and  Prevents  Oxidative  Damage  Following  Ischemia/Reperfusion[J].  NIH Public Access Transplant Proc, 2009,41(10): 409-4098.

[15]  Kazushige  Oishi,  Satoshi  Hagiwara,  Satoko  Koga,  et  al.  The  Vitamin  E  Derivative, EPC-K1, Suppresses Inflammation During Hepatic Ischemia-Reperfusion Injury and Exerts Hepatoprotective Effects in Rats[J]. Journal of Surgical Research ,2012, 176:164-170.

[16] Bradley D, Medling Reuben Bueno, Christopher Chambers. et al. The Effect of Vitamin E Succinate on Ischemia Reperfusion Injury[J]. HAND ,2010, 5:60-64.

[17] Hironori  Koga,  Satoshi  Hagiwara,  ,Hideto  Mei,  et  al.  The  Vitamin  E  Derivative, ESero S-GS,  Attenuates  Renal  Ischemia-Reperfusion  Injury  in  Rats[J].  Journal  of  Surgical Research ,2012,176:220-225.

请按以下提纲填写:

1、研究意义;2、国内外研究现状;3、本项目的创新之处;4、主要参考文献及出处(格式:论文:作者.题目.刊名.年份.卷(期).页码;专著:作者.书名.出版者.年份)。

五、研究方案

1、研究内容、研究目标和拟解决的关键问题

研究目标:

本研究拟探讨维生素 E及低温联合应用对大鼠单侧睾丸扭转复位的保护作用,为临床睾丸扭转的治疗提供实验依据以期能够改善该病术后并发症的出现。

研究内容:

睾丸扭转复位后抗氧化能力下降、活性氧生成增多和大量钙离子内流使睾丸细胞凋亡增加可导致睾丸生精能力下降;维生素 E 通过增强组织 SOD 活力、减少 MDA 的产生,以及抑制组织细胞因子的产生,而改善扭转睾丸的组织结构以及减少睾丸组织的细胞凋亡,有效对抗睾丸缺血再灌注损伤,进而保护扭转复位后的睾丸组织;低温能抑制氧自由基的产生及其引发的脂质过氧化反应;二者均可使生殖细胞凋亡降低,保护扭转复位睾丸的生精功能。

拟解决的关键问题:

 本实验采用常规睾丸扭转动物实验模型,对复位前紧急使用维生素 E 及低温是否能够通过其抗氧化能力、抑制炎症因子表达、调控细胞凋亡等作用而有效减轻睾丸IRI 做一研究。

2、研究计划的总体进度及安排

本项目用时共24个月,参与人数7人,其中硕士1人,学士6人,人才梯度合理,分工合作适当。具体进度与安排如下:

(1)2016.02-2016.06健康青春期SD大鼠编号编号分组;

(2)2016.07-2016.12 大鼠睾丸扭转模型制备;

(3)2017.01-2017.05 流式细胞术检测凋亡细胞;

(4)2017.06-2017.10 免疫组化;

(5)2017.11-2018.01 实验结果数据统计分析整理,编写论文等。

3、拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

技术路线

(1) 对60只健康青春期SD大鼠编号,采用数字随机法随机分成五组(A、B、C、D、E组),每组12只,A组为睾丸扭转组,B组为睾丸扭转加维生素E组,C组为睾丸扭转加低温组,D组为睾丸扭转加维生素E、低温组,E组为对照组;

(2) 建立单侧(左侧)睾丸扭转模型,并依据设计对各组施加处理因素,术后3天各组处死6只大鼠;

(3) 取手术侧睾丸平均分为3部分,第一部分入液氮保存,检测cat、sod、gshpx活性和MDA含量,第二部分入4%多聚甲醛溶液保存,常规做石蜡切片行HE染色,光境下观察组织学变化,第三部分快速入4°C生理盐水中行流式细胞术检测凋亡细胞百分比。

(4) 术后60天处死剩余动物,取手术侧睾丸,常规石蜡包埋,行HE染色,行睾丸组织的平均makler评分(testicular mak1er score,TMS)。

(5) 数据采用卡方检验比较,任两组间比较采用LSD检验。

实验方案

2.1研究内容:

2.1.1实验动物

选取雄性60只健康青春期SD大鼠,每个大鼠均行标号。月龄均为1月,随机分组分成两组,五组(A、B、C、D、E组),每组12只。A组为睾丸扭转组,B组为睾丸扭转加维生素E组,C组为睾丸扭转加低温组,D组为睾丸扭转加维生素E、低温组,E组为对照组。

2.1.2手术干预方式

建立单侧(左侧)睾丸扭转模型,并依据设计对各组施加处理因素,手术提取大鼠部分睾丸组织并行冰冻保存。具体如下:动物麻醉后,大鼠仰卧固定。均行阴囊右侧切口进入 ,切开阴囊,切开白膜,暴露右侧睾丸。游离取出右侧约一半睾丸组织性冷冻,剩下残留在睾丸里的睾丸组织行止血缝合白膜及阴囊及皮肤。睾丸组织行冷冻方法:睾丸组织用DMEM培养基加入二甲基亚砜配制冷冻保存液,最终放如-80℃超低温冰箱中保存起来。对照组15只不进行手术。

2.1.3检测成年大鼠性激素水平

到3月龄检测实验组及对照组大鼠各组mda含量、sod、cat、GSHPX活性、睾丸细胞凋亡百分比及睾丸的生精功能(TMS),具体方法:用 10%水合氯醛麻醉后,断尾尖取血,室温静置30min ,血块收缩后,800×g离心10min,吸取上层血清,按照试剂盒所附的实验方法分检测。

2.1.4检测各组行性激素水平测定,睾丸部位睾丸间质细胞及实验组部位睾丸间质细胞形态变化。

具体方法:用10%水合氯醛麻醉后,行断尾法取血,室温静置30min ,血块收缩后,800×g离心10min,吸取上层血清,按照试剂盒所附的实验方法分检测血清性激素水平。将10只对照组大鼠左侧睾丸组织及10只大鼠左侧睾丸组织及背部移植部位睾丸组织取出迅速置于4%戊二醛固定液 (pH 7.2 )中。30 m in后,将组织块取出,切成 3 m m ×5 m m 大小,放回4%戊二醛固定液中4 ℃固定。由新疆医科大学电镜中心制备电镜切片,并在透射电镜下观察、摄片。

可行性分析:

首先,该项目立项理由充分。睾丸扭转复位后可导致缺血再灌注损伤,在复位前对睾丸运用低温保护技术,可提高扭转睾丸的耐缺血能力,在一定程度上减轻睾丸组织的缺血再灌注损伤,提高睾丸的生存能力。同时维生素E也能减轻睾丸组织的缺血再灌注损伤。二者作为协同作用,降低组织代谢及ATP的消耗,从而减轻再灌注时自由基的产生量,提高组织的抗氧化能力,减轻自由基对组织损伤的作用,提高对自由基的清除能力,减轻生精细胞的凋亡,提高复位睾丸的生精功能,因此,我们可以考虑在睾丸扭转患者得到确诊至手术前用冰袋将其覆盖,尽可能减少睾丸的损害,复位时应用抗氧化维生素E,对挽救睾丸扭转患者的生育功能有重要意义。

其次,本项目主要由东营人民医院泌尿外科、病理科科研团队完成。团队分工合作,分别参与动物模型制备、免疫组化、流式细胞学等实验设计、技术支持、实验操作等方面工作。人力与硬件条件充足,为该项目立项提供主观条件。本项目主持者薄学军硕士在泌尿男性生殖治疗方面拥有丰富的经验,为该项目提供决策性指导;团队成员具备丰富的实验室管理经验和实验操作以及极高的科研素质。本院中心实验室和检验科具备完成本项目所具备的基础硬件设施和仪器设备等。以上是本项目能够进行的必要以及充分条件。

4、本研究的特色和创新之处

鉴于目前对睾丸缺血再灌注损伤的研究均为单一因素的保护性治疗作用,多种因素混合作用下的保护作用的研究未见报道,而且对单因素作用及多因素作用保护效果有无差异还缺少这方面的探讨。

本实验建立睾丸扭转复位动物模型,进行不同的处理,测定各组mda含量、sod、cat、GSHPX活性、睾丸细胞凋亡百分比及睾丸的生精功能(TMS),探讨维生素E、低温在大鼠睾丸扭转复位后睾丸I/R损伤中的保护作用,以及各组间作用的差异。探讨多种保护因素的共同作用对减少睾丸损伤的作用效果,探讨能减轻再灌注损伤的最佳方法,既提高睾丸手术复位后的生存力,又能提高复位睾丸的生理功能,为临床治疗提供理论依据。

5、研究工作预期结果或成果形式及主要经济、社会效益指标

预期结果:

睾丸扭转复位后抗氧化能力下降、活性氧生成增多和大量钙离子内流使睾丸细胞凋亡增加可导致睾丸生精能力下降;维生素 E 通过增强组织 SOD 活力、减少 MDA 的产生,以及抑制组织细胞因子的产生,而改善扭转睾丸的组织结构以及减少睾丸组织的细胞凋亡,有效对抗睾丸缺血再灌注损伤,进而保护扭转复位后的睾丸组织。;低温能抑制氧自由基的产生及其引发的脂质过氧化反应;二者均可使生殖细胞凋亡降低,保护扭转复位睾丸的生精功能;维生素 E和低温联合应用能更好的提高扭转复位睾丸的抗氧化能力,减轻活性氧的释放,从而减少生殖细胞的凋亡,保护睾丸的生精功能。

经济和社会效益:

睾丸扭转患者得到确诊至手术前用冰袋将其覆盖,尽可能减少睾丸的损害,复位时应用抗氧化维生素E,对挽救睾丸扭转患者的生育功能有重要意义。

六、研究条件与基础

1、申请者近期发表的与本项目有关的主要论著目录和科研成果名称、获奖情况;与本研究有关的研究工作积累和工作成绩. 

2、实现本项研究已有的主要仪器设备;尚缺的仪器设备和拟解决的途径.   

本项目已有设备:大鼠,免疫组化及流式细胞学设备,相应设备可以提供使用。

3、申请者近期承担的其他项目名称(包括国家级、省部级及厅局级各类科技计划)及完成情况。

2009.09  局麻下经尿道前列腺电切的临床应用研究                                    已完成

2009.09  BDNF、HIF-1α双基因修饰神经干细胞移植治疗脊髓损伤后神经细胞凋亡的研究   已完成

2009.09  MMP-2反义寡核苷酸对裸鼠膀胱癌治疗作用的研究                             已完成

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