（1. 山西医科大学，山西 太原 030001；*通讯作者：山西医科大学第二医院肾内科，山西 太原 030001）
摘要: 目的 对特发性膜性肾病患者尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白( NGAL)及肾损伤分子－１（KIM-1）的水平进行检测，探讨二者与肾小管间质损伤和IMN病理分期的关系，由此判断其临床价值。方法 将2017年5月到2018年8月在我院行肾脏穿刺活组织检查确诊为特发性膜性肾病（IMN)的患者81例作为病例组，同期我院健康体检者55例作为对照组，收集两组一般及临床资料，对所有研究对象行尿NGAL及KIM-1检测。依据Ehrenreich-Churg分期法将病例组分为I期、I-II期、II期三组。另参照Banff病理评价标准将患者按肾小管间质损伤程度分为轻度、中度和重度三组；对不同组别患者尿NGAL及KIM-1水平进行比较，分析二者与肾小管间质损伤相关临床化验指标，如：α1微球蛋白(α1-MG) 、尿 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶( NAG)及尿视黄醇结合蛋白( RBP)的相关性，并绘制IMN肾小管间质损伤诊断效能的ROC曲线。结果 两组一般资料相比差异无统计学意义（P＞0.05），而尿KIM-1和NGAL水平相比，差异均有统计学意义（P＜0.01))。病例组随着损伤加重，肾小管间质损伤评分、尿KIM-1和NGAL水平明显升高，差异均具有统计学意义（P＜0.01))，且组间两两比较差异有统计学意义（P＜0.05)。Spearman直线相关分析显示，IMN患者尿KIM-1和NGAL与肾小管损伤相关化验指标呈正相关（P均＜0.05)。ROC曲线结果显示，尿NGAL和KIM-1联合检测的曲线下面积最大(AUC = 0.916)，特异度和灵敏度为92.7%和75.3%。结论 尿KIM-1和NGAL与IMN肾小管间质损伤严重程度密切相关，且可反映IMN病理损伤严重程度，二者联合检测对诊断IMN肾小管损伤具有较高的临床价值。
关键词:特发性膜性肾病；中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白；肾损伤分子-1；肾小管间质损伤；尿液
中图分类号：R692 文献标识码：A
Clinical value of combined detection of urinary KIM-1 and NGAL in idiopathic membranous nephropathy
HUO Fei-xia1,ZHU Guo-zhen 2
1 Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China
2 Department of Nephrology, The Second Clinical Medical College, Shanxi Medical University,Taiyuan 030001, China
Abstract: objective To detect urinary neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) and renal injury molecule-1 (KIM-1) levels in patients with idiopathic membranous nephropathy (IMN) and then explore their relationship with tubulointerstitial injury , so as to judge its clinical value. Methods Eighty-one patients with idiopathic membranous nephropathy (IMN) diagnosed by renal biopsy in our hospital from May 2017 to August 2018 were taken as case group, and fifty-five healthy people in the same period in our hospital were taken as control group. The general and clinical data of two groups were collected, and urine NGAL and KIM-1 were detected in all subjects. The cases group were divided into stage I, stage I-II and stage II groups according to Ehrenreich-Churg staging method. In addition, according to the pathological evaluation criteria of Banff, the pathological degrees of renal tubulointerstitium were divided into mild, moderate and severe groups. The levels of urinary NGAL and KIM-1 in patients from different groups were compared, and the clinical laboratory indicators related to renal tubulointerstitial injury such as α1 microglobulin (α1-MG), urinary N- acetyl -β-D- glucosaminidase (NAG) and urinary retinol binding protein (RBP) were analyzed with them. The ROC curve of diagnostic efficacy for IMN renal tubulointerstitial injury was drawn. Results There was no significant difference in general data between the two groups (P > 0.05).but there were evident discrepancies in urine KIM-1 and NGAL levels (P < 0.01). With the aggravation of injury, the renal tubulointerstitial injury score, urinary KIM-1 and NGAL levels in the case group increased apparently(P < 0.01) and the divergences were statistically prominent between the interblock of two case groups (P < 0.05). Spearman linear correlation analysis showed that KIM-1 and NGAL in urine of IMN patients were positively correlated with related test indexes of renal tubular injury (P < 0.05). The ROC curve results showed a maximum area under the curve (AUC = 0.916) for urine NGAL and KIM-1 joint testing, with specificity and sensitivity of 92.7% and 75.1%. Conclusion Urinary KIM-1 and NGAL are closely related to the severity of tubulointerstitial injury of IMN, and can reflect the severity of its pathological damage . The combined detection of Kim-1 and NGAL has high clinical value in diagnosing tubulointerstitial injury of IMN.
Keywords :Idiopathic membranous nephropathy ;Neutrophil gelatinase-associated lipocalin ;Kidney injury molecule-1;Renal tubular interstitial injury ;Urine
特发性膜性肾病（idiopathic membranous nephropathy，IMN）为成年人肾病综合征最常见的病理类型，其主要病理表现为肾小球脏层上皮细胞下免疫复合物沉积和肾小球基膜增厚［1］。预后差异较大，轻者可自行缓解，重者可进展至终末期肾脏病。目前临床诊疗和预后监测主要通过肾穿刺活检病理检查和蛋白尿，由于它们各自存在一定的局限性，使得IMN的诊断和治疗仍面临很多困难。而尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)和尿肾损伤分子-1(KIM-1)是近年来被广泛研究的肾小管早期损伤标志物。它们在肾小管损伤后迅速升高，其升高水平与肾小管损伤程度、肾组织纤维化及炎症程度密切相关[2,3]。目前IMN被看作是一种肾小球疾病，但在肾活检中，IMN的病理表现为肾小球和肾小管间质的异常。尽管如此，尿NGAL和KIM-1在IMN中的作用却很少被研究。本研究拟对我院经肾活检确诊的IMN患者尿KIM-1及NGAL的水平进行检测，探讨两者与IMN病理分期、肾小管间质病理损伤及相关化验指标的关系，由此判断其临床应用价值。
1资料与方法
1.1一般资料
病例组选自山西医科大学第二医院肾内科2017年5月到2018年8月行肾穿刺活检确诊为特发性膜性肾病(IMN)的患者，总数为81例。纳入标准:(1)初发肾病综合征且在我院行肾穿刺活检确诊为特发性膜性肾病的患者; (2)肾穿刺活检前未行激素、 免疫抑制剂治疗。排除标准:(1)糖尿病、系统性红斑狼疮、紫癜性肾炎、类风湿性关节炎肾损害、乙肝病毒相关性肾炎、尿酸性肾病、肥胖相关肾脏病、多发性骨髓瘤、肿瘤等继发性膜性肾病者;(2)合并各种急慢性感染、急性肾损伤、伴有严重基础疾病者。其中男女患者分别为52例和29例， 平均年龄（46.78±12.07）岁。依据Ehrenreich-Churg分期法，将病例组分为Ⅰ期、Ⅰ-Ⅱ期、Ⅱ期三组；此外，根据肾小管间质病理损伤严重程度将病例组患者再分为轻度损伤组33例，中度损伤组29例，重度损伤组19例；选择本院同期健康体检人群作为对照组(55 例)。以上患者均知情并签署知情同意书。
1. 2 方法
1. 2. 1 临床资料收集 对受试者的一般资料，包括性别、年龄、体重指数进行收集。病例组在肾穿刺当日早晨留取血、尿标本进行检测，并记录病例组尿视黄醇结合蛋白( RBP) 、尿α1微球蛋白(α1-MG) 及尿 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶( NAG) 等肾小管间质损伤相关临床化验指标。
1. 2. 2 尿液NGAL和KIM-1的检测 在肾穿前1天留取病例组患者清洁中段晨尿10ml，而对照组则在体检当日清晨留取清洁中段尿10ml，均进行离心后留取上层清液。人KIM-1 和人NGAL的酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自上海西唐生物科技。并按照试剂盒使用步骤检测尿液KIM-1以及NGAL的水平。
1. 2. 3肾脏病理 所有入选患者肾穿刺活检标本，作病理石蜡切片，均进行常规染色，行光镜、免疫荧光、电镜检查。膜性肾病按Ehrenreich-Churg分期法可分为五期，由于该入选病例病理分期均为Ⅰ期、Ⅰ-Ⅱ期、Ⅱ期，因此病例组分为Ⅰ期、Ⅰ-Ⅱ期、Ⅱ期三组。肾小管间质病变包括肾小管变性、坏死、 管型、肥大、萎缩、再生等，肾间质水肿、肉芽肿、炎症和纤维化等［4］， 肾小管间质损伤严重程度根据Banff病理评价标准按每张切片肾小管损伤占标本的比例进行评分:0%～5%为1分、6%～25%为2分、＞25%为3分，并依次分为轻度、中度、重度三组。
1. 3 统计学方法 用SPSS25.0统计软件进行统计学处理，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较用成组t检验；计数资料采用χ2检验；而非正态分布的计量资料采用中位数(四分位数间距)表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验，三组间比较采用Kruskal-Wallis检验，三组间任意两组比较用LSD-t检验，相关性分析采用Spearman检验，诊断效能评价用ROC曲线分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 病例组与对照组一般资料及尿KIM-1与尿NGAL水平的比较
病例组与对照组相比，性别、年龄、体重指数差异无统计学意义（P＞
0.05），病例组尿KIM-1和NGAL的水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P均＜0.01)。祥见表1。
表1 两组间一般资料及尿KIM-1与NGAL水平的比较
分组 例数（男/女） 年龄(岁） 体重脂数(kg/m2) 尿KIM-1(ng/ml) 尿NGAL(ng/ml)
病例组 81（52/29） 46.78±12.07 25.34±4.02 0.49（0.15-1.44） 34.72（21.15-72.92）
对照组 55（28/27） 45.89±11.27 24.43±1.53 0.06（0.04-0.17） 9.54（6.17-19.56）
统计量 2.39 0.44 1.61 -6.91 -7.38
P 0.12 0.66 0.11 0.00 0.00
2.2 不同病理分期的病例组患者一般资料、肾小管间质损伤评分、尿KIM-1及NGAL水平的比较
在81例IMN患者中，Ⅰ期、Ⅰ-Ⅱ期、Ⅱ期三组患者一般资料（如：性别、年龄、体重指数）相比，差异无统计学意义（P＞0.05)，尿KIM-1及NGAL水平比较，差异有统计学意义（P均＜0.01)。此外，Ⅰ-Ⅱ期与Ⅰ期的组相比，差异有统计学意义（*P＜ 0.05），Ⅱ期分别与Ⅰ期、Ⅰ-Ⅱ期两组相比，差异有统计学意义（*#P＜ 0.05）。详见表2。
表2 不同病理分期的IMN患者一般资料、肾小管间质损伤评分、尿KIM-1及NGAL水平比较
观察指标 Ⅰ期 Ⅰ-Ⅱ期 Ⅱ期 统计量 P
例数（男/女） 16（9/7） 24（11/13） 41（25/16） 1.41 0.49
年龄(岁） 50.25±9.66 44.67±12.13 46.66±12.81 1.03 0.36
体重指数(kg/m2) 24.07±4.28 26.11±4.01 25.39±3.89 1.26 0.29
肾小管间质损伤评分（分） 1.19±0.54 1.75±0.68* 2.12±0.78*# 10.17 0.00
尿KIM-1(ng/ml) 0.11（0.06-0.27） 0.59（0.21-1.04）* 0.95（0.26-1.73）*# 8.41 0.00
尿NGAL(ng/ml) 21.42（10.56-27.88）38.01（21.84-53.01）* 49.69（30.70-86.63）*# 10.4 0.00
注：与I期比较*P＜ 0.05；与I期和I-II期两组比较*#P＜0.05。
2.3 病例组不同肾小管间质病理损伤患者尿KIM-1和NGAL水平的比较
在81例IMN患者中，肾小管间质损伤轻度、中度、重度三组尿KIM-1和NGAL的水平比较差异有统计学意义（P均＜0.01），并且中度与轻度组相比差异有统计学意义（*P＜0.05），重度组分别于轻度组和中度组相比，差异有统计学意义（*#P＜0.05）。祥见表3。
表3 病例组不同肾小管间质病理损伤患者尿KIM-1和NGAL水平的比较
肾小管间质损伤程度分组 KIM-1（ng/ml） 尿NGAL（ng/ml）
轻度（33例） 0.17（0.08-0.68） 21.94（17.12-36.01）
中度（29例） 0.43(0.17-1.46)* 36.31(26.15-45.85)*
重度（19例） 1.58（0.58-2.19）*# 88.85（74.46-103.86）*#
F 12.26 45.35
P 0.00 0.00
注：与轻度比较*P＜0.05；与轻度和中度两组比较*#P＜0.05。
2.4 病例组尿KIM-1和NGAL与肾小管间质损伤相关临床化验指标的相关性分析
采用Spearman直线相关分析，发现在IMN患者中，尿KIM-1与尿RBP、尿α1-MG、尿NAG呈正相关(r值分别为0.346，0.223,0.365,P均＜0.05)。尿NGAL与尿RBP、尿α1-MG、尿NAG呈正相关(r值分别为0.260,0.234,0.277,P均＜ 0.05）。详见表4。
表4 病例组尿KIM-1和NGAL与肾小管间质损伤相关化验指标的相关性分析
化验指标 尿 KIM-1 尿NGAL
r p r p
尿α1- MG 0.346 ＜0.05 0.260 ＜0.05
尿NAG 0.223 ＜0.05 0.234 ＜0.05
尿RBP 0.365 ＜0.05 0.277 ＜0.05
2.5 绘制IMN患者肾小管间质损伤诊断效能的ROC曲线
本研究通过绘制尿KIM-1、尿NGAL、二者联合检测及其它肾小管损伤相关临床化验指标对IMN肾小管间质损伤诊断效能的ROC曲线。可以观察到尿KIM-1、NGAL、及二者联合检测的曲线下面积依次升高分别为(AUC = 0.850，0. 874，0.916)，特异度和灵敏度分别为[95.1%和63.6%，92.6%和69.1%，92.7%和75.3%]。而尿RBP、α1- MG、NAG的曲线下面积分别为( AUC = 0.712，0.636，0.719)，特异度和灵敏度分别为[51.9%和81.8%，58.0%和67.3%，59.35%和83.6%]。见图1。
图 1 尿NGAL、尿KIM-1及二者联合检测与尿NAG、
RBP、α1- MG 对诊断IMN 肾小管间质损伤的ROC曲线
3 讨论
IMN是一种病因不明的肾小球疾病，是成人肾病综合征最常见的病理类型，以肾小球基底膜增厚为病理主要表现,并伴有肾小管间质损伤。其严重程度与肾小球功能损害密切相关，目前临床主要通过蛋白尿来预测疾病进展[1，5]，但其发病滞后于肾小管间质损伤。然而，有关肾小管间质损伤标记物在IMN中的研究却非常局限，目前尚不清楚尿标志物是否能够反映IMN病理分期及与肾小管间质损伤的关系。
KIM-1 是免疫球蛋白基因超家族的一员，主要表达于形态相对正常的受损近端小管上皮细胞[6]，并且，尿KIM-1 的升高在急慢性肾损伤中可早于血肌酐水平的升高，监测尿KIM-1水平有助于早期诊断肾损伤[5]。而NGAL作为载脂蛋白家族的新成员，可自由通过肾小球滤过屏障并大部分被肾小管重吸收，并在正常肾组织中少量表达。当肾小管上皮细胞受损时，可以观察到尿NGAL的表达会显著升高［7，8］，其通过促进受损的肾小管间质细胞再生、修复和诱导中性粒细胞凋亡来保护肾功能［3］。尿NGAL作为急慢性肾脏疾病肾小管间质损伤的早期敏感的新型生物学指标已被证实[9，10]。但尿KIM-1和NGAL在IMN中的研究却非常局限，目前尚不清楚它们是否能够早期反映IMN病理损伤分期和肾小管间质损伤的严重程度。故本研究旨在通过联合检测IMN患者尿KIM-1和NGAL的水平，探讨二者与IMN病理分期、肾小管间质损伤的关系，由此判断其临床应用价值。
本研究结果表明，IMN患者尿KIM-1和NGAL水平显著高于健康人群，并且随着病理分期的升高明显上升，提示尿KIM-1和NGAL水平可反映IMN病理损伤的严重程度。此外，随着IMN病理损伤加重，肾小管间质损伤评分也明显升高，提示IMN肾小管间质损伤严重程度与病理损伤密切相关。另外，在肾小管间质损伤程度方面，可以发现随着损伤程度的加重，尿KIM-1和NGAL水平呈明显升高趋势，并且组间两两比较差异具有统计学意义，从而证实了An[11]等人的推测，并对其实验进行了完善。直线相关分析显示，尿KIM-1和NGAL分别与传统的反映肾小管间质损伤的化验指标，如尿NAG、RBP及α1- MG呈正相关。绘制尿NGAL、KIM-1、二者联合检测及尿NAG、RBP、α1- MG对IMN肾小管间质损伤诊断效能的ROC曲线，提示尿KIM-1、NGAL及二者联合检测的曲线下面积依次升高并且明显高于RBP、α1- MG、NAG，由此可知，在IMN肾小管损伤诊断方面尿NGAL优于KIM-1和传统指标，这与Maas等人[12]的研究结论一致。但是，另有研究表明，尿NGAL和KIM-1水平在不同的疾病状态下具有一定的差异性，如在高盐摄入下血压正常的大鼠肾损伤模型中观察到，尿NGAL水平明显升高，但尿KIM-1水平没有发生变化［13］。然而，在氨基糖苷类药物暴露相关的急性和慢性近端肾小管损伤中，相比于尿NGAL，尿KIM-1则是更敏感的指标［14］。此外，通过研究还可发现，尿NGAL和KIM-1联合检测对IMN肾小管间质损伤诊断价值更高，故推测尿NGAL和KIM-1参与了IMN肾小管间质损伤的发生发展，可作为IMN肾小管间质损伤的早期诊断指标。总之，本研究结果表明，尿NGAL和KIM-1水平可间接反映IMN病理分期的严重程度，并且随着病理分期的升高肾小管间质损伤评分逐渐升高。尿NGAL和KIM-1的水平可以反映IMN肾小管间质病理损伤的严重程度，并且与传统肾小管间质损伤的化验指标密切相关，在诊断IMN肾小管间质损伤方面尿NGAL和KIM-1联合检测明显优于传统指标。
该研究的局限性在于：首先，该研究目前正在对所研究对象进行随访，但由于随访时间不够长，尚不足以评估尿NGAL和KIM-1的水平对IMN长期预后是否具有判断价值。其次，本研究没有其它疾病状态的病例作为对照，尚不清楚尿NGAL和KIM-1在其他肾脏疾病肾小管损伤中的作用。因此，未来本课题组会将上述因素考虑在内，以进一步明确肾小管间质损伤标志物在包括IMN在内的其它肾脏疾病中的应用价值。
综上所述，尿KIM-1和尿NGAL与IMN肾小管间质损伤严重程度密切相关，并且可以反映IMN病理损伤严重程度，二者联合检测对诊断IMN肾小管间质损伤具有较高的临床价值。
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