林仁志1  郑晨辉1  管紫涵1  陈琪2  何炎静1

浙江省台州市中心医院（1肿瘤外科；2精准实验中心） 浙江 台州 318000

摘要：目的：探究异甘草酸镁通过PI3K/AKT对乳腺癌细胞的影响。方法：在ATCC细胞库购买乳腺癌细胞株，随机分为三组，第一组，乳腺癌组（BC组）：单纯乳腺癌细胞株不做其他处理，正常培养；第二组，低浓度组（LC组）：将乳腺癌细胞株与50μmol/L异甘草酸镁溶液混合培养；第三组，高浓度组（HC组）：将乳腺癌细胞株与500μmol/L异甘草酸镁溶液混合培养。通过TUNEL法、cck-8法、Westernblot法、qRT-PCR法分析三组乳腺癌细胞凋亡、增殖情况、PI3K-AKT的蛋白含量、PI3K-AKTmRNA的表达含量的差异性来探究异甘草酸镁通过PI3K-AKT对乳腺癌细胞的影响。结果：检测结果显示，BC组、LC组、HC组乳腺癌细胞凋亡率分别为23.68%、46.84%、89.38%。BC组乳腺癌细胞凋亡数量最少，HC组乳腺癌细胞大量凋亡，HC组与BC组、LC组相比较细胞凋亡率显著升高，LC组与BC组相比较，LC组细胞凋亡数量多于BC组(均P＜0.05)。BC组、LC组细胞增殖OD值比HC组高，组间比较具有明显差异（p＜0.05），BC组乳腺癌细胞的增殖数量最多，HC组乳腺癌细胞的增殖数量最少，LC组乳腺癌细胞的增殖情况比BC组相比明显减少（p＜0.05）。通过Western blot法,对BC组、LC组、HC组乳腺癌细胞内的PI3K/AKT蛋白进行免疫印迹，灰度显示，BC组的PI3K-AKT蛋白含量最高，HC组蛋白含量最低，HC组和BC组、LC组相比较，乳腺癌细胞中PI3K-AKT蛋白含量降低，LC组与BC组相比较，LC组蛋白含量明显低于BC组(均P<0.05)。qRT-PCR检测结果显示，HC组乳腺癌细胞内的PI3K/AKT mRNA表达量最低，BC组乳腺癌细胞内的PI3K-AKT mRNA表达量最高，HC组与BC组、LC组相比较，PI3K-AKT mRNA含量显著下降，LC组与BC组相比较，LC组mRNA表达量明显低于BC组(均P<0.05)。结论：异甘草酸镁可促进乳腺癌细胞凋亡，抑制其增长，其作用机制可能与抑制PI3K-AKT蛋白的表达有关，且异甘草酸镁浓度与乳腺癌细胞成正相关。

关键词：异甘草酸镁；乳腺癌；PI3K-AKT；凋亡；

Effect of magnesium isoglycyrrhizinate on apoptosis of breast cancer cells and its effect on PI3K-AKT signaling pathway

Lin renzhi 1 zheng chenhui 1 guan zihan 1 Chen qi 2 he yanjing 1Zhejiang taizhou central hospital (1 department of oncology surgery; 2 precision experimental center) taizhou, zhejiang 318000

Abstract: Objective:To investigate the effects of magnesium isoglycyrrhizinate on apoptosis of breast cancer cells and its effect on PI3K-AKT signaling pathway. METHODS: Breast cancer cell lines were purchased from the ATCC cell bank and randomly divided into three groups. The first group, the breast cancer group (BC group): the simple breast cancer cell line was not treated with other treatments, and the normal culture; the second group, the low concentration group (LC group): breast cancer cell line was mixed with 50 μmol/L magnesium isoglycyrrhizinate solution; the third group, high concentration group (HC group): the breast cancer cell line was mixed with 500 μmol/L magnesium isoglycyrrhizinate solution. The TUNEL method, cck-8 method, Western blot method and qRT-PCR method were used to analyze the difference of apoptosis, proliferation, protein content of PI3K-AKT and expression of PI3K-AKT mRNA in three groups of breast cancer cells to explore the mammary gland induced by magnesium isoglycyrrhizinate. Apoptosis of cancer cells and its effect on the PI3K-AKT signaling pathway. Results: The results showed that the apoptosis rates of breast cancer cells in BC group, LC group and HC group were 23.68%, 46.84% and 89.38%, respectively. The number of apoptosis of breast cancer cells in BC group was the least, and the apoptosis of breast cancer cells in HC group was a great deal.  of apoptosis of breast cancer cells in BC group was the least, and the apoptosis of breast cancer cells in HC group was a great deal.Significantly more than the BC group (both P <0.05). The OD value of cell proliferation in BC group and LC The proliferation of breast cancer cells was the highest in BC group, and the proliferation ofThe proliferation of breast cancer cells was the highest in BC group, and the proliferation of breast cancer cells in HC group was the least. The proliferation of cells was significantly reduced compared with the BC group (p<0.05). Immunoblotting of PI3K-AKT protein in breast cancer cells of BC group, LC group and HC group by Western blot showed that the PG group had the highest PI3K-AKT protein content and the HC group had the lowest protein content, HC group and Compared with the BC group and the LC group, the content of PI3K-AKT protein in breast cancer cells was decreased. Compared with the BC group,  the LC group, the content of PI3K-AKT protein in breast cancer cells was decreased. Compared with the BC group,  qRT-PCR showed that the expression of PI3K-AKT mRNA was the lowest in breast cancer cells of HC group, and the expression of PI3K-AKT mRNA was the highest in breast cancer cells of BC group. Compared with BC group and LC group, PI3K- The AKT mRNA content decreased significantly. Compared with the BC group, the mRNA expression of the LC group was significantly lower than that of the BC group (both P<0.05). Conclusion: Magnesium isoglycyrrhizinate can promote the apoptosis and inhibit the growth of breast cancer cells. Its mechanism may be related to the inhibition of PI3K-AKT protein expression, and the concentration of magnesium isoglycyrrhizinate is positively correlated with breast cancer cells.

Key words: magnesium isoglycyrrhizinate; breast cancer; PI3K-AKT; apoptosis;

引言：乳腺癌（Breast cancer）作为常见的肿瘤之一，是国内外女性癌症死亡的诱因之一[1]。全世界平均每年新增乳腺癌患者人数众多，不同国家，乳腺癌的发病率也不同。我国乳腺癌趋于年轻化，比其他国家女性早10到15年[2]。中国属于发病率较低的国家，但是，近年来的增长速度却持续升高。根据数据显示：我国在沿海地区的城市的女性发病率高于其他地区[3]。乳腺癌的病因相当的复杂，该病的发生与遗传、环境等多种因素有关[4]。已引起临床及科研人员高度关注，正逐步加深治疗乳腺癌的相关研究[5]。虽然现在手术治疗，术后的放、化疗发展迅速，对乳腺癌患者作用明显，能显著提高患者生存时间，但仍不能阻碍癌细胞的转移。因此，寻求更加综合、有效的治疗方案是当今医学研究的热点[6]。异甘草酸镁（MGL）是从天然甘草中获取的，具有消炎、抗氧化的作用[7]。临床上，异甘草酸镁在许多疾病（胰腺癌、肺癌）中都发挥关键作用，能够抑制肿瘤细胞的活性，延缓其增殖速率，但异甘草酸镁在乳腺癌中是否有治疗效果尚未有相关结论得出。PI3K/AKT是由多种细胞因子介导的信号通路[8]。研究显示，该信号通路有调节细胞翻译、迁移等作用[9]。当代医学中,PI3K和Akt信号转导途径在乳腺癌中的研究文献较少，导致在乳腺癌的临床医学诊断和治疗方法及手段中提供理论依据较少[10]。因此，本篇文章通过TUNEL法、cck-8法、Westernblot法、qRT-PCR法分析三组乳腺癌细胞凋亡、增殖情况、PI3K-AKT的蛋白含量、PI3K-AKTmRNA的表达含量的差异性来探究异甘草酸镁诱导乳腺癌细胞凋亡及对PI3K-AKT信号通路的影响。

1资料与方法

1.1一般资料

在ATCC细胞库购买乳腺癌细胞株，随机分为三组，第一组，乳腺癌组（BC组）：单纯乳腺癌细胞株不做其他处理，正常培养；第二组，低浓度组（LC组）：将乳腺癌细胞株与50μmol/L异甘草酸镁溶液混合培养；第三组，高浓度组（HC组）：将乳腺癌细胞株与500μmol/L异甘草酸镁溶液混合培养。

1.2实验仪器与试剂

异甘草酸镁（上海胜隆实业有限公司）；CCK-8 试剂盒（北京杰辉博高生物技术有限公司）；恒温摇床（成都苏净器材公司）。

1.3细胞培养

将乳腺癌细胞株在含有胎牛血清的DMEM培育液中培养。当细胞数量为80%-90%时，胰蛋白酶消化乳腺癌细胞，消化后，采取1600r/min进行离心，时间为5min，收集、重悬并培养细胞。分别将乳腺癌细胞株与50μmol/L、500μmol/L的异甘草酸镁溶液混合培养。

1.4TUNEL法检测乳腺癌细胞凋亡

将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为70%-80%满。随后严格按照厂家说明书进行TUNEL染色。加Vectashield Hard Set 封固涂片样本，标记反应，于荧光显微镜下观察染色结果并拍照。

1.5cck-8法对乳腺癌细胞增殖数量进行检测

取出转染后的细胞，稀释为1×10⁵/mL，培养12h。取培养好的乳腺癌细胞平铺到16孔板中，并培养。培养到一定数量后，加入CCK-8 10μL。常温放置30分钟，利用读板器检测450nm光密度值（OD值）。

1.6Westernblot法检测乳腺癌细胞中PI3K-AKT的蛋白含量

取乳腺癌细胞50μg，洗净烘干电泳槽及其它部件，制备12%分离胶，制作1cm的水层。将电泳装置放置聚胶1h，配制灌注成层胶。90V电泳，溴酚蓝倒入分离胶，取出凝胶，放入PVDF膜5-10秒。冰浴，杂交液稀释一抗，GAPDH: 1:1000。清洗3次，把膜放入对应的二抗中常温孵育1.5小时，轻轻晃动。加入ECLA和B混合液约1分钟，PVDF膜检测采用自动化学发光成像分析。

1.7qRT-PCR法检测乳腺癌细胞中PI3K-AKT的表达含量

在乳腺癌细胞株培养液中加入氯仿，摇荡，离心，使溶液呈乳白状，4℃1200转离心，加异丙醇，离心，加75%乙醇离心，干燥，-80℃保存。总ＲNA提取反转录成cDNA，按照说明书进行实验，内参采用GAPDH，60°C，10 min、95℃、72°C，各 30 s 、95℃，5 min，循环次数以40为准，实验次数至少3次，用相对定量2-ΔΔCT计算miR-34a表达，

表1引物序列

1.8统计学分析

通过SPSS22.0软件进行结果整理，通过分析BC组、LC组、HC组乳腺癌细胞凋亡情况、增殖情况、PI3K-AKT的蛋白含量、PI3K-AKT mRNA表达量的差异性用t检验P<0.05。

2结果BC组LC组HC组

2.1三组乳腺癌细胞凋亡情况比较

检测结果显示，BC组、LC组、HC组乳腺癌细胞凋亡率分别为23.68%、46.84%、89.38%。BC组乳腺癌细胞凋亡数量最少，HC组乳腺癌细胞大量凋亡，HC组与BC组、LC组相比较细胞凋亡率显著升高，LC组与BC组相比较，LC组细胞凋亡数量多于BC组(均P＜0.05)。结果如图1。

图1三组乳腺癌细胞凋亡情况

A表示三组乳腺癌细胞细胞凋亡情况，B表示三组乳腺癌细胞凋亡率，★：与BC组比较p＜0.05，√：与LC组相比较p＜0.05

2.2cck-8法检测三组乳腺癌细胞增殖情况

BC组、LC组细胞增殖OD值比HC组高，组间比较具有明显差异（p＜0.05），BC组乳腺癌细胞的增殖数量最多，HC组乳腺癌细胞的增殖数量最少，LC组乳腺癌细胞的增殖情况比BC组相比明显减少（p＜0.05）。结果如图2。

图2三组乳腺癌细胞增殖情况

★：与BC组比较p＜0.05，√：与LC组相比较p＜0.05

2.3三组乳腺癌细胞中PI3K-AKT的蛋白含量

通过Western blot法,对BC组、LC组、HC组乳腺癌细胞内的PI3K-AKT蛋白进行免疫印迹，灰度显示，BC组的PI3K-AKT蛋白含量最高，HC组蛋白含量最低，HC组和BC组、LC组相比较，乳腺癌细胞中PI3K-AKT蛋白含量降低，LC组与BC组相比较，LC组蛋白含量明显低于BC组(均P<0.05)。结果见图3。

图3乳腺癌细胞中PI3K-AKT的蛋白含量

A表示三组乳腺癌细胞中PI3K-AKT的蛋白含量，B表示三组乳腺癌细胞中蛋白含量比较，★：与BC组比较p＜0.05，√：与LC组相比较p＜0.05

2.4乳腺癌细胞中PI3K/AKTmRNA的表达含量

qRT-PCR检测结果显示，HC组乳腺癌细胞内的PI3K-AKT mRNA表达量最低，BC组乳腺癌细胞内的PI3K-AKT mRNA表达量最高，HC组与BC组、LC组相比较，PI3K-AKT mRNA含量显著下降，LC组与BC组相比较，LC组mRNA表达量明显低于BC组(均P<0.05)。结果如图4。

图4三组乳腺癌细胞中PI3K-AKT mRNA表达量

★：与BC组比较p＜0.05，√：与LC组相比较p＜0.05

讨论

乳腺癌作为一种常见的恶性肿瘤，乳腺癌发病率已位居妇科癌症首位[11]。几年来，我国在治疗乳腺癌方面获得了较多的成就，手术、化疗、内分泌及靶向治疗方式，在减轻患者痛苦的基础上，也从根本上提高了部分患者5年-10年间的生存率，但癌细胞转移情况时有发生，发生率也同样居高不下[12]。随着临床工作者的不断探索，除常规手术之外的多种治疗手段，也在患者身上得到了应用，但早期乳腺癌的治疗方法仍局限于手术开刀，放疗加上药物治疗手术患者生存率也开始小幅度提升[13]｡

本文研究结果显示，HC组与BC组、LC组相比较细胞凋亡率显著升高，LC组与BC组相比较，LC组细胞凋亡明显多于BC组。BC组、LC组细胞增殖OD值比HC组高，组间比较具有明显差异，LC组乳腺癌细胞的增殖情况比BC组相比明显减少。灰度显示，HC组和BC组、LC组相比较，乳腺癌细胞中PI3K-AKT蛋白含量降低，LC组与BC组相比较，LC组蛋白含量明显低于BC组。检测结果显示，HC组与BC组、LC组相比较，PI3K-AKT mRNA含量显著下降，LC组与BC组相比较，LC组mRNA表达量明显低于BC组。研究结果表明，异甘草酸镁可以显著抑制乳腺癌细胞的增殖，且作用效果与异甘草酸镁的浓度有一定依赖性，异甘草酸镁浓度越高，抑制效果越显著[14-15]。同时，亦有实验结果显示，异甘草酸镁在胃癌患者体内发挥效应显著，能够明显降低癌细胞的活性，促进其凋亡。以上实验结果表明，异甘草酸镁能够对癌细胞起到抑制作用，从而达到治疗的目的[16-17]。在动物实验中发现，异甘草酸镁作用于患病大鼠时，大鼠体内PI3K-AKT的表达水平随之下降，且异甘草酸镁的浓度与PI3K-AKT的表达水平呈负相关关系，即异甘草酸镁的浓度越高，PI3K-AKT的表达水平越低[18]。大量研究表明，异甘草酸镁可诱导乳腺癌细胞大量凋亡，降低细胞增殖速度，其机制可能与抑制PI3K-AKT信号转导通路有关，为乳腺癌的诊断和治疗发展新方向[19-20]。本实验的研究结果与上述结论均相同。

综上所述：异甘草酸镁可促进乳腺癌细胞凋亡，抑制其增长，其作用机制可能与抑制PI3K-AKT蛋白的表达有关,且异甘草酸镁浓度与乳腺癌细胞成正相关。

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