一、立项依据与研究内容：
（一）项目的立项依据
原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，我国的肝癌发病数占全球所有肝癌病例的一半左右，因此我国对于肝癌的研究显得非常迫切[1]。肝癌非常容易转移，其复发转移是治疗失败的主要原因。了解肝癌侵袭转移的相关机制，对于设计合理的治疗药物，进一步提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义[2]。
E-cadherin在肝癌细胞的侵袭、转移中起到了不可忽视的作用。E-cadherin属于钙粘附蛋白家族(Cadherin 家族)，在调节细胞与细胞之间、细胞与基质之间的粘附反应，介导细胞间的接触抑制和凋亡等方面发挥重要作用。E-cadherin与β-catenin、p120等形成复合体发挥上述功能[3]。
E-cadherin与多种肿瘤的浸润转移密切相关[ 4-5 ]。有人认为提高E-cadherin的表达可以成为肿瘤治疗的一个方向[6]。与其他肿瘤类似，研究表明E-cadherin在肝细胞癌的阳性率显著低于癌旁组织及正常肝组织，表达越低则肿瘤病理分级越差，也越容易出现转移[7-9]。有人报道缺乏E-cadherin表达的人肝癌细胞株非常容易发生转移，但是转染E-cadherin后这种特性发生逆转，说明E-cadherin在肝癌细胞转移过程中发挥着重要的作用[10]。
E-cadherin丧失或低表达的机制至今仍然不是完全清楚。目前认为可能是由于基因突变导致功能丧失、启动子甲基化后转录沉默[11]以及E-cadherin蛋白被磷酸化后水解等。但是在亚洲人群中基因突变和启动子甲基化都不常见[12-13] 。因此最大的可能性是E-cadherin蛋白被磷酸化后水解。有文献证明，酪氨酸残基磷酸化的E-cadherin能够与Hakai（一种E3泛素连接酶）结合，使其泛素化而降解[14 ]。那么有多少酪氨酸激酶参与这个机制呢？有报道EGFR，IGF-1R能够磷酸化E-cadherin。对于E-cadherin磷酸化的调节机制目前仍然不是非常明确。
为了解E-cadherin在肝癌细胞的分子信号通路，我们以E-cadherin（胞内段）为诱饵应用酵母双杂交（CytoTRAP系统）在肝脏的cDNA文库中筛选到一个新的能与E-cadherin相互作用的非受体型酪氨酸激酶-Pyk2。那么，Pyk2是否能磷酸化E-cadherin并调节细胞迁移呢？
Pyk2(proline rich tyrosine kinase 2)是一种富含脯氨酸的非受体型酪氨酸蛋白激酶，与FAK同源度较高，属于FAK家族。Pyk2是酪氨酸激酶家族中的后起之秀，在调节细胞存活、增殖和迁移[16]方面受到越来越多的关注。Pyk2信号通路的活化能够增强细胞运动和迁移，研究发现Pyk2在多种肿瘤的侵袭和转移中起作用[17-18]。其中Sun等研究表明， Pyk2在59%的肝癌组织中表达上调， Pyk2高表达与肝癌组织体积、Edmonson分级呈正相关， Pyk2表达越高病人预后越差。动物实验显示在侵袭边缘的肝癌细胞和转移到肺结节中的肝癌细胞均发现Pyk2高表达。肝癌细胞株转染Pyk2后，其迁移功能增强；而用裸鼠做实验发现抑制Pyk2的活性后肝癌肿瘤的大小和肺转移率都较对照明显减少[19-20]。
Pyk2调节肿瘤转移的具体机制是什么呢？有研究表明，在肝癌细胞中，Pyk2提高c-Src的磷酸化水平和活性，与c-Src形成复合体激活ERK通路，从而增强肝癌细胞的侵袭性[19-20]；也有报道Pyk2与 PECAM-1（血小板/内皮细胞粘附分子，与E-cadherin一样都属于钙粘附蛋白家族）结合并且都影响肿瘤细胞的侵袭性[21] ；还有报道RhoC通过激活Pyk2促进前列腺癌转移[18]以及与SOCS3、Cyr61有关等 [22-23]。总而言之，目前Pyk2调节肿瘤细胞转移的具体机制仍不十分清楚。
Pyk2与E-cadherin能否结合并调节肝癌细胞的侵袭转移呢？这是我们想要研究的问题。我们继续应用酵母双杂交反复验证、GST-Pulldown实验、免疫共沉淀证明二者相互作用是可靠的（具体结果见研究基础）。那么，现在的问题是二者在体内状态下是否结合？结合后的调节机制是什么？二者的结合位点在什么地方？结合后如何调节细胞迁移以及影响肿瘤转移？
考虑到Pyk2是一个激酶蛋白，我们的前期工作发现E-cadherin与Pyk2的激酶部分结合，因此有两种可能性。一种是Pyk2磷酸化E-cadherin，另外一种就是E-cadherin抑制Pyk2的磷酸激酶活性。我们认为第一种可能性较大。有文献报道，Pyk2能磷酸化VE-cadherin（E-cadherin同源家族成员）并且抑制其与Catenin，P120等形成复合体[24-25]。E-cadherin与VE-cadherin同源性很高，理化性质相似，Pyk2能够磷酸化VE-cadherin应该也有可能磷酸化E-cadherin。因此我们有理由推测，由于肿瘤始动因素的作用，Pyk2表达增多，活性增强，从而磷酸化E-cadherin，导致E-cadherin降解，最终使细胞迁移性增强。但是也不能排除第二种可能性，E-cadherin抑制Pyk2的磷酸激酶活性，从而导致肿瘤细胞侵袭性下降。申请人以前的工作就发现钙粘附蛋白家族的另外一个成员γ- Protocadherins能够抑制Pyk2的活性[26]，申请人做这方面工作时曾取E-cadherin做对比参照，结果发现抑制Pyk2激酶活性不是很明显（本数据未发表），因此不支持第二种可能性。二者具体如何调节还需要进一步实验来证实。
本课题的设计主要是为了解答上述问题。首先在前期工作基础上继续明确Pyk2与E-cadherin能相互作用以及调节机制；其次应用细胞迁移实验确定二者的调节对肿瘤细胞迁移、侵袭性的影响；然后应用裸鼠成瘤转移实验明确二者的调节在对肝癌远处转移的影响；最后分析在肝癌病人组织标本中二者表达的相关性以及与转移的相关性。本课题在国际上最新发现Pyk2与E-cadherin直接相互作用，并且确定其结合机制，明确这种调节与肝癌细胞迁移力和肿瘤转移的关系。这对于肝癌侵袭转移的复杂机制有新的理解。许多新型抗癌药物如赫赛汀、格列卫、吉非替尼、厄洛替尼都是以酪氨酸激酶为治疗靶点，取得非常好的疗效。本研究对于确定E-cadherin和酪氨酸激酶Pyk2做为分子治疗靶点、设计合理的治疗药物可以提供更有利的素材。
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（二）项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。
１.主要研究内容
1）确定E-cadherin与Pyk2体外、体内相互作用、作用位点以及调节关系。
A．取E-cadherin与Pyk2不同结构域和不同突变体，应用酵母双杂交、GST-Pull Down以及免疫共沉淀的方法确定二者相互作用的结构域，以及作用位点。
B.选取二者表达量都适中的肝癌组织，行内源性免疫共沉淀，证明在体内二者也相互作用。
C.应用免疫荧光技术和蔗糖密度梯度超速离心方法分析细胞组分的方法确定E-cadherin与Pyk2在细胞中共定位。
D.应用磷酸化实验，确定E-cadherin是否是Pyk2的底物，应用定点突变的方法，确定酪氨酸的磷酸化位点。（同时再次确证E-cadherin能否影响Pyk2激酶活性。）
2）从细胞水平确定Pyk2对E-cadherin的调节影响细胞迁移。
A.筛选Pyk2稳定表达细胞株，然后应用Transwell细胞迁移实验观察过表达Pyk2的细胞其迁移性、侵袭性的变化，检测过表达Pyk2时E-cadherin的磷酸化状态和蛋白水平的变化，确定Pyk2对E-cadherin磷酸化状态的调节影响细胞迁移。
B.取高转移肝癌细胞株MHCC97-H 、HCCLM3 (购自上海中山医院肝癌研究所)，应用RNAi技术沉默Pyk2的表达，观察细胞迁移性、侵袭性的变化，检测相应状态下E-cadherin的磷酸化状态和表达水平的变化。从相反方向确定Pyk2的表达抑制后对E-cadherin磷酸化状态的调节，以及这种调节对细胞迁移的影响。
3）从动物模型水平确定Pyk2对E-cadherin的调节影响肿瘤转移。
应用Pyk2稳定表达细胞株接种裸鼠，观察裸鼠肿瘤肺转移肝转移情况，分析Pyk2的过表达对E-cadherin磷酸化状态的调节关系，以及与肿瘤转移的相关性。
4）从肝癌病人标本中寻找Pyk2与E-cadherin磷酸化状态的相关性，以及与肿瘤转移的的相关性。
收集肝癌标本，应用免疫组化和Western等方法确定Pyk2的表达水平的变化与E-cadherin磷酸化状态和蛋白水平的相关性，以及二者与肿瘤转移的相关性。
２.研究目标
1）确定Pyk2结合E-cadherin相互作用的结构域及磷酸化位点，并阐明其调节机制。
2）确定Pyk2与E-cadherin的调节可影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移。
３.拟解决的关键科学问题
E-cadherin酪氨酸残基的磷酸化导致其被降解，增加细胞侵袭性。本课题能够确定酪氨酸激酶Pyk2能否磷酸化E-cadherin，Pyk2与E-cadherin的调节是否是调节肿瘤细胞转移的新的分子机制。
（三）拟采取的研究方案及可行性分析。
１.研究方法
GST-pull down，荧光共定位，内源、外源免疫共沉淀，蔗糖密度梯度超速离心，磷酸化实验，定点突变，稳定表达细胞株的筛选，RNAi抑制Pyk2表达，细胞迁移、侵袭实验，裸鼠成瘤肿瘤转移实验，免疫组化，定量PCR，Western检测等。
２.关键技术说明：
1）磷酸化实验
首先应用酪氨酸激酶的通用底物E4Y1作为阳性参照，以纯化的GST-E-cadherin蛋白为底物，以GST蛋白作为阴性对照，观察Pyk2 是否可以磷酸化E-cadherin。如果能磷酸化E-cadherin则应用生物信息分析，定点突变，寻找磷酸化位点；如果不能磷酸化E-cadherin，则以通用底物E4Y1作为底物，加入不同量的E-cadherin观察是否可以影响Pyk2的激酶活性。
2）细胞迁移实验
首先分别用空载体PCDNA3.1， PCDNA3.1-Pyk2-Myc，PCDNA3.1-PRNK-Myc转染肝癌细胞株（PRNK为Pyk2的C段，为Pyk2的失活突变体），用G418筛选出稳定表达细胞株。并检测稳定表达细胞株Pyk2蛋白表达量的不同。
然后应用稳定表达细胞株做Transwell细胞迁移和侵袭实验，比较细胞迁移率的变化；检测细胞迁移率的变化与Pyk2蛋白表达量的关系。同时取相应细胞做定量PCR，Western蛋白定量，磷酸化抗体检测磷酸化状态来比较E-cadherin在转录水平、蛋白水平、磷酸化水平的变化以及这些变化与肿瘤迁移的关系，与Pyk2蛋白表达量的关系。
3）裸鼠成瘤肿瘤转移实验
取上述三组稳定表达细胞株分别接种裸鼠，待肿瘤直径约1-1.5cm时取出肿瘤重新接种于另外一批裸鼠的肝左叶。接种5星期左右处死裸鼠，收集肝脏和肺脏，观察肝内转移情况和肺转移情况。检测三组肿瘤Pyk2蛋白表达量的不同以及与肿瘤转移的关系。同时取相应肿瘤做定量PCR，Western蛋白定量，磷酸化抗体检测磷酸化状态来比较E-cadherin在转录水平、蛋白水平、磷酸化水平的变化，确定这些变化与肿瘤转移的关系，与Pyk2蛋白表达量的关系。
4）蔗糖密度梯度超速离心定位和内源免疫共沉淀
取肝癌肿瘤的癌旁组织，裂解离心，取裂解液上清，蔗糖密度梯度超速离心。取离心后的不同组分样品做Western，分别用E-cadherin抗体和Pyk2抗体作为一抗检测。如果二者表达最多的峰值是在同一个组分中，则提示我们二者在细胞内是共定位的。
取上述二者的表达较多的组分，用Pyk2单抗免疫沉淀Pyk2（免疫球蛋白作对照），然后用E-cadherin单抗杂交检测E-cadherin是否能与Pyk2共沉淀下来。相反方向则是：用E-cadherin单抗免疫沉淀E-cadherin（免疫球蛋白作对照），然后用Pyk2单抗杂交检测Pyk2是否能与E-cadherin共沉淀下来。
３.技术路线（见下图）
1. 左侧部分：取E-cadherin与Pyk2不同结构域和不同突变体，应用酵母双杂交、GST-Pull Down以及免疫共沉淀的方法确定二者相互作用的结构域，以及作用位点。荧光共定位，免疫组化，蔗糖密度梯度超速离心等方法验证二者在细胞以及肿瘤组织中共定位；磷酸化实验确定E-cadherin是Pyk2的磷酸化底物，以及磷酸化位点。这部分内容从生化的角度确定Pyk2磷酸化E-cadherin的分子机制。
2. 中间部分：通过细胞迁移实验、裸鼠成瘤转移实验从细胞水平、动物模型确定：Pyk2通过磷酸化E-cadherin影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移的机制。
3. 右侧部分：收集肝癌病人标本和临床资料，通过免疫组化、Western等方法检测E-cadherin /Pyk2蛋白水平、磷酸化状态，分析二者表达量的相关性，以及与肝癌转移的相关性。
4. 最下面部分为汇总数据，总结分析。
4.可行性分析
1） 前期实验已经从酵母双杂交、GST-Pull Down、免疫共沉淀等证实了E-cadherin与Pyk2相互作用(见研究基础部分)，而且二者功能上密切相关。E-cadherin作为一种细胞黏附分子在细胞黏附、细胞迁移和接触抑制方面具有作用。而Pyk2能通过各种信号途径参与调节细胞黏附、扩散和迁移等过程。因此，二者在功能上是有互相作用基础的。
考虑到Pyk2是一个激酶蛋白，且前期实验结果提示Pyk2激酶区域结合E-cadherin，因此有两种可能，一种是Pyk2磷酸化E-cadherin，另外一种是E-cadherin抑制Pyk2激酶活性。我们认为第一种可能性较大。根据文献报道，Pyk2能磷酸化E-cadherin的同源蛋白VE-cadherin并且抑制其与Catenin、P120等形成复合体，从而影响细胞迁移。E-cadherin与VE-cadherin同源性很高，理化性质相似，Pyk2能够磷酸化VE-cadherin应该就有可能磷酸化E-cadherin。因此我们有理由推测，由于肿瘤始动因素的作用，Pyk2表达增多，活性增强，从而磷酸化E-cadherin，导致E-cadherin降解，最终使细胞迁移性增强。我们上述实验设计基本基于这个逻辑。磷酸化实验证实Pyk2磷酸化E-cadherin，导致E-cadherin蛋白减少。细胞迁移实验和动物实验设计逻辑是通过Pyk2过表达，检测E-cadherin磷酸化增强，蛋白量减少，导致细胞迁移增强或者肿瘤转移增加；RNAi抑制Pyk2的表达，则出现相反的结果，E-cadherin磷酸化减弱，蛋白量增加，导致细胞侵袭性减弱和肿瘤肺转移减少。事实是否如此，需要实验来证明。
申请人以前的工作曾发现钙粘附蛋白家族的另外一个成员γ- Protocadherins能够抑制Pyk2的活性，因此从逻辑上讲也不能完全排除第二种可能性，即E-cadherin抑制Pyk2的磷酸激酶活性。如果是这样的话，则可能的假设是：在正常细胞中，E-cadherin抑制Pyk2的活性，在肿瘤条件下，由于其他原因E-cadherin减少或消失，而不能抑制Pyk2活性，导致Pyk2活性增强，因而肿瘤细胞迁移性增强。如果基于这个逻辑的话，实验设计就要改变为：磷酸化实验时应用酪氨酸激酶的通用底物E4Y1作为底物，观察E-cadherin对Pyk2激酶活性是否有抑制作用。然后筛选E-cadherin过表达、功能失活突变体和空载体的稳定表达肝癌细胞株，然后行细胞迁移实验和裸鼠成瘤实验，观察E-cadherin蛋白过表达或功能失活突变后与细胞迁移或者肿瘤转移的关系，同时检测其与Pyk2蛋白表达量及磷酸化水平相关性。但是申请人在完成γ- Protocadherins抑制Pyk2的活性的工作中曾取E-cadherin做对比参照，结果发现E-cadherin抑制Pyk2激酶活性不是很明显，因此这种可能性不大。
从上面的分析来看，本课题在理论和逻辑上是可行的。
2）本课题是本人前期工作的延续，本人对E-cadherin/Pyk2的研究非常熟悉，前期工作构建的质粒表达载体等为本课题的下一步研究提供了很多有利的条件。本课题组的成员对所需要的技术方法都很熟练，且都有相应的工作基础，可以在各个方面进行协作。
3）本课题所涉及的技术均为较成熟的技术，所需的设备和条件本校都具备。
（四）本课题的特色与创新之处
1.本课题通过酵母双杂交新发现一个与E-cadherin相互作用的蛋白--非受体型酪氨酸激酶Pyk2，并证明两者的相互作用可靠，国内外研究至今未曾见过报道，具有国际先进性和独创性。（有报道二者的表达量与肿瘤转移的关系，但是二者直接相互作用未见报道。）
2. 本课题新发现Pyk2磷酸化E-cadherin影响肝癌细胞转移的机制，对于E-cadherin在肝癌转移过程中的分子机制有新的理解，因此具有独创性和先进性。
（五）年度研究计划及预期研究结果
1.年度研究计划
2011.01-2011.12 磷酸化实验确定二者的调节关系，肝癌组织内源免疫共沉淀确定相互作用可靠，同时确定二者结合的结构域，磷酸化位点。蔗糖密度梯度超速离心，荧光共定位等相关的实验进一步确证二者共定位。同时收集病例标本，收集临床资料。纯化蛋白制备抗体。
2012.01-2012.12 细胞迁移实验，裸鼠成瘤肿瘤转移实验检测Pyk2的表达与E-cadherin的磷酸化状态，以及细胞迁移的关系，确定其调节机制。同时完成E-cadherin/Pyk2的表达以及磷酸化状态与肝癌的分期、转移、预后、复发等临床指标的相关性分析。
2013.01-2013.12 补充实验遗漏，整理实验资料，统计处理实验数据，撰写论文。
2.预期研究结果
1)确定Pyk2能够磷酸化E-cadherin，以及二者相互作用的结构域以及磷酸化位点。
2)确定Pyk2通过磷酸化E-cadherin，从而影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移。
3)确定在肝癌组织中E-cadherin蛋白水平、磷酸化状态和Pyk2表达量的相关性，以及二者的表达与肝癌转移的相关性。
4)在国外学术期刊上发表SCI论文2-4篇，其中影响因子大于5的有一篇以上。在国内核心期刊发表论文2-4篇，并在国内外学术会议交流。
5)培养研究生2-3名。
二、研究基础与工作条件
（一） 研究基础
第一步：为了研究肝癌转移的机制，首先选取E-cadherin（胞内段，以下实验同）为诱饵在肝脏的cDNA文库中做酵母双杂交，寻找与E-cadherin相互作用的蛋白。我们先选取的是LACZ系统蓝白斑筛选，但是因为背景高而放弃。后来选取CytoTRAP系统，背景明显减低，测序后有意义的基因有31个。其中有4个为Pyk2片段。通过克隆Pyk2基因全
长验证，确定二者在酵母中的相互作用是强阳性的（图1）。（同时验证Pyk2的同源蛋白FAK与E-cadherin相互作用为可疑弱阳性）。
图1 酵母双杂交（CytoTRAP系统）验证Pyk2与E-cadherin相互作用
pMyr-Lamin为阴性对照，pMyr-SB为阳性对照，E-Cad为E-Cadherin缩写，以下图示与此相同。Psos-E-Cad为诱饵蛋白。CytoTRAP系统酵母双杂交特点为两个蛋白如果不相互作用在25℃时可以生长，而在37℃则不能生长,如阴性对照pMyr-Lamin所示。两个蛋白如果相互作用则在两个温度下都能生长,如阳性对照pMyr-SB所示，pMyr-Pyk2与阳性对照相似。
第二步：原核表达E-cadherin和His-Pyk2进行GST-Pulldown。为了验证二者是直接结合，我们分别细菌中表达纯化GST-E-cadherin和His-Pyk2，可惜His-Pyk2全长非常难纯化，得不到纯化的蛋白。我们表达纯化了His-Pyk2的激酶部分。GST-Pulldown实验结果证实Pyk2的激酶部分能够与E-cadherin直接结合（图2）。
泳道 1 2 3
图2 原核表达E-cadherin和His-Pyk2激酶部分进行GST-Pulldown。
分别原核表达GST、GST-E-cadherin和His-Pyk2激酶部分，取等量GST、GST-E-cadherin分别与相同量的His-Pyk2激酶部分混合，加入谷胱甘肽琼脂糖珠孵育，重复洗三次，用his抗体Western检测，结果显示His-Pyk2激酶部分能够与GST-E-cadherin结合（泳道3），而不能与GST结合（泳道2），泳道1上图是纯化的His-Pyk2激酶部分的蛋白作为检测标准。
第三步：原核表达E-cadherin和细胞表达Myc-Pyk2进行GST-Pulldown。我们转染Myc-Pyk2于SYF细胞（SYF细胞株是酪氨酸激酶c-Src, Yes,和Fyn敲除的胚鼠中的成纤维细胞建成的细胞系，用这个细胞株可以排除Src等其他非受体型酪氨酸激酶的干扰。），实验结果发现GST-E-cadherin可以与真核表达的Myc-Pyk2全长结合，而GST作为对照不能与之结合（图3）。
泳道 1 2 3
图3 原核表达E-cadherin和细胞表达Myc-Pyk2进行GST-Pulldown。
转染Myc-Pyk2于SYF细胞，裂解细胞取上清，取等量GST、GST-E-cadherin分别与相同量的细胞上清混合，加入谷胱甘肽琼脂糖珠孵育，重复洗三次，用Myc抗体Western检测，结果显示Myc-Pyk2能够与GST-E-cadherin结合（泳道3），而不能与GST结合（泳道2），上图泳道1是细胞裂解液上清，检测到Myc-Pyk2蛋白作为Pulldown的参照。
第四步：我们在SYF细胞株中应用外源性免疫共沉淀技术验证，即Flag -E-cadherin和Myc-Pyk2共转染SYF细胞，结果证明二者仍然是相互作用的（图4）。
泳道 1 2 3 4 5 6
图4 Flag -E-cadherin和Myc-Pyk2免疫共沉淀结果
三组SYF细胞分别转染Myc-Pyk2、Flag -E-cadherin和共转（泳道1，2，3），左侧Input：Western检测蛋白表达量；右侧IP（泳道4，5，6），下图（泳道5，6）检测用Flag抗体沉淀下来的Flag -E-cadherin，结果发现Myc-Pyk2能被Flag -E-cadherin沉淀下来（上图泳道6），而对照不能（上图泳道4，5））。
上述实验都重复三次以上确保可重复性。这些数据让我们相信二者的相互作用是比较可靠的。本课题是申请者在原工作基础上的继续和深入。申请者一直专注于肿瘤信号通路的研究，尤其是肝癌的转移方面。因此对本课题的背景和技术都非常熟悉。参加人员都有良好的科研背景以及相关方面的特长。因此，我们具有完成本课题的切实可行的、扎实的工作基础。
（二）工作条件
本课题组所在学校的附属医院具有病例收集的良好条件，同时学校领导非常支持，本校及合作单位拥有国家重点实验室，具有设备完善而先进的的分子生物学、细胞生物学、蛋白质组学、生物信息学、组织病理技术等实验平台。课题组的成员也具有团结协作创新的精神、求实的科学态度，多名成员已发表SCI论文，为本项研究工作提供有利的人力资源。
（三）申请人和项目组主要成员简历
三、其他附件清单
医学伦理委员会审批件。
